V-ATP酶V1H调控牙和骨发育的机制研究

Vacuolar-ATPase is one of the important molecules to regulate osteoclast function. Two subunits of vacuolar-ATPase have been reported to be related with the human genetic bone diseases or abnormal bone phenotypes in gene knockout mice, which usually accompanied with abnormal teeth. In our previous clinical work, we found a pedigree with V1H subunit mutation of vacuolar-ATPase and the patients showed abnormal bone and tooth development. In order to test whether H subunit has a similar function in osteoclast as other two subunits, we will set up Atp6v1h gene knockout mice using CRISPR/Cas9 technique, observe the general, bone and tooth characteristics in gene knockout mice, and explore the H subunit function in osteoclasts and osteoblasts and its interaction with other subunits. We put forward this scientific question based on the clinical findings as well as the preliminary research data. Our results might contribute to finding the functions of ATP6V1H during bone and tooth formation.

囊泡型ATP酶（vacuolar-ATPase,V-ATPase）是调节破骨细胞功能的一个重要分子，目前已知其两个亚单位的编码基因与人类遗传性的骨骼疾病或基因敲除小鼠模型的骨异常有关，并伴随一定的牙发育异常。在前期临床实践中，我们收集了一个伴随囊泡型ATP酶V1H亚单位基因突变的遗传家系，患者表现出骨骼和牙的异常，为证明V1H亚单位的功能及其与其他亚单位的关系，拟采用CRISPR/Cas9技术构建Atp6v1h基因敲除小鼠，对其进行全身、骨骼、牙发育特征的详尽观察，探讨V1H亚单位在调节破骨细胞和成骨细胞生长和分化的作用，及其与其他亚单位之间的互动关系。本研究结合前期临床发现的问题以及已有的实验基础提出科学问题，旨在阐明囊泡型ATPase V1H亚单位的生物学功能及其致病的机理。

囊泡型 ATP 酶（ vacuolar-ATPase, V-ATPase）是调节破骨细胞功能的重要分子，以往研究发现其两个亚单位的编码基因与人类遗传性骨病或基因敲除小鼠模型的骨异常有关。本课题的核心在于：发现质子泵的H亚基的编码基因ATP6V1H是一个新的调控破骨细胞功能和骨密度的重要分子。研究内容包括：1开展了1625例中国人群骨密度调查分析，发现ATP6V1H基因多态性与骨密度高低存在关联；2通过家系研究、外显子组测序等方法，发现ATP6V1H的基因突变伴随异常骨骼表型； 3通过CRISPR/Cas9技术建立了Atp6v1h基因敲除小鼠，发现纯合子小鼠致死，随以杂合子小鼠为主要实验对象展开了系列的体内和体外研究，明确该分子调控破骨细胞、成骨细胞和骨密度的机制。4 通过CRISPR/Cas9技术建立Atp6v1h基因敲除斑马鱼，再次验证其调控骨改建的机制。5 利用以上小鼠模型和斑马鱼模型、生物信息学分析、体外模型等，最终深入研究ATP6V1H的分子特征、在调控破骨细胞、成骨细胞和骨密度的机制。6 采用GEFOS大数据和转录组测序等技术，分析了ATP6V1H与质子泵其他亚基的关系，提出来多因素综合调控骨密度的机制。以上研究证实了ATP6V1H与人骨密度存在一定的相关性、证实了ATP6V1H基因突变可导致遗传性骨病、证实了ATP6V1H调控破骨细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞及其相互作用，综合调控骨密度和骨改建，且其可能与TGF-beta1、MMP9和MMP13相关。此外，我们发现ATP6V1H两个转录本在结构、功能等方面不同，存在组织特异性分布，其调控颅颌骨发育的机制亦不同，也发现H亚基与囊泡型ATP酶的其他亚基如d2等存在互动，通过多种机制调控骨密度。本研究属于原创性的研究，其科学意义在于首次对ATP6V1H在遗传性骨病和骨密度调控方面的作用展开了系列研究，涉及人群、家系、小鼠和斑马鱼模型等体内和体外效应，有更广泛的意义，这些结果也为研发新的抗骨质吸收药物、提供了新的研究靶标和可能性。