酶耦联催化儿茶素定向转化茶黄素的反应机理研究

茶黄素和茶红素是红茶的重要品质成分，研究证实，红茶中茶黄素主要由多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）催化儿茶素氧化形成，两种酶作用方式略不同。同时，由于茶叶中简单儿茶素含量不高，且对茶黄素的形成至关重要。本项目拟利用单宁酶可切断儿茶酚与没食子酸间酯键的特性，通过单宁酶水解茶多酚的研究，获得儿茶素组成比例均衡的复合物。以上述复合物为底物，针对酶促耦联氧化反应中，儿茶素底物竞争性以及PPO、POD酶对八种儿茶素催化专一能力不明确等问题，研究PPO、POD对不同儿茶素底物的竞争性，获得底物竞争性反应次序，建立儿茶素定向转化茶黄素的优化体系，系统地阐明儿茶素定向转化反应机理及控制方法。对反应产物进行制备、分离，完成结构的分析和鉴定，并比较其抗氧化功效，筛选抗氧化活性产物；通过急性、慢性毒性实验，评价高抗氧化活性反应产物的安全性。最终实现安全的、高活性的茶黄素产物的体外定向生物转化。

本研究运用单宁酶的水解催化特性，系统研究了反应参数（酶、温度、底物、反应时间）对酯型儿茶素含量变化及简单儿茶素生成量的影响。通过设计正交试验，筛选优化的单宁酶-茶多酚水解体系，获得了可用于调控成分比例的水解动力学方程，实现茶多酚底物组成的定向调控。应用上述反应产物，研究多酚氧化酶、过氧化物酶及儿茶素底物体外合成茶黄素的反应机制。研究结果明确了多酚氧化酶对茶多酚底物亲和性优于过氧化物酶；过氧化物酶对茶黄素底物的亲和性优于茶多酚底物，因此要定向生物合成茶黄素应避免过氧化物酶的消极作用。四种儿茶素底物中EGCG与酶的亲和性最高，与茶黄素单体TF3的高形成量相关；通过调控简单儿茶素EC和EGC的比例，获得相应的TF1产物，可望实现TF1的体外高效生物合成。利用大孔树脂和半制备色谱技术可以高效、快速地分离制备高纯度茶黄素单体，该方法可进一步放大并用于大规模生产。此外，通过四种茶黄素单体体外清除活性氧自由基的能力及抗DNA氧化损伤的功能研究，阐明了茶黄素单体的构效关系。本项目研究结果为茶黄素在医药、保健品等领域的广泛应用提供了理论和实验依据。