还原型β2-GPI抑制巨噬细胞致糖尿病动脉粥样硬化的作用机制

课题组在对β2-糖蛋白I（β2-GPI）与糖尿病血管并发症为期7年的研究基础上，首次发现了机体中存在还原型β2-GPI，且该蛋白水平与糖尿病动脉粥样硬化进展成负相关。由此提出如下假说：还原型β2-GPI与巨噬细胞表面受体结合, 下调细胞内p38MAPK信号转导通路,阻抑动脉粥样硬化斑块的形成与进展，从而对糖尿病大血管病变起保护作用 。本研究拟以巨噬细胞U937和β2-GPI基因敲除糖尿病小鼠为研究对象，采用噬菌体展示、液/气相色谱、活体生物发光三维成像、蛋白芯片技术等手段，分别从分子细胞水平、动物整体水平，深入探讨还原型β2-GPI与巨噬细胞的作用靶点及对细胞内p38MAPK信号转导通路的影响，力求为临床寻求一种更敏感、更特异的糖尿病动脉粥样硬化的预测和监控指标，完善糖尿病动脉粥样硬化发病机制，为进一步防治糖尿病动脉粥样硬化提供新思路。

以动脉粥样硬化为主要病变特征的糖尿病大血管并发症导致的病死率占糖尿病患者死亡率的80%，给社会和家庭造成了巨大负担。大量循证医学证据（如UKPDS、ADVANCE、VADT研究等）证实：即便是严格控制糖脂代谢的紊乱，仍然无法完全阻止糖尿病动脉粥样硬化的进展，因此进一步明确糖尿病的发病机制，寻求从源头阻断糖尿病动脉粥样硬化进展的防治方案，是医学界急需解决的关键问题。课题组首次发现了机体中存在还原型β2-GPI，且该蛋白水平与糖尿病动脉粥样硬化进展成负相关。本研究采用sf9昆虫细胞和bac-to-bac杆状病毒，建立β2-GPI的高效表达体系，联合Ni-NTA agarose亲和纯化进行蛋白的纯化和从人血浆中提取β2-GPI，TRX-1法和巯基保护法成功获得还原型β2-GPI。以RAW264.7巨噬细胞为研究对象，探讨了还原型β2-GPI对巨噬细胞泡沫化和摄取脂质能力及对巨噬细胞凋亡的影响；采用实时定量PCR技术观察还原型β2-GPI对巨噬细胞脂质摄取相关受体SR-BI,CD36，ABCA1，ABCG1表达的影响；采用Western blot技术完成还原型β2-GPI对巨噬细胞P38MAPK信号通路关键蛋白casepase3，casepase9，p-p38 MAPK和p-JNK的影响。以BALB/C糖尿病动脉粥样硬化小鼠为研究对象，运用光、电镜等形态学手段结合免疫组化技术观察还原型β2-GPI对主动脉粥样硬化形成的影响；采用荧光实时PCR相对定量分析还原型β2-GPI对糖尿病小鼠主动脉胆固醇摄入及流出细胞的相关受体表达的影响； Western 免疫印迹分析还原型β2-GPI对巨噬细胞P38MAPK信号通路和MMP2、MMP9、TIMP-1、TIMP-2的影响；蛋白芯片技术分析还原型β2-GPI对主动脉炎症效应分子的表达水平的调控作用。研究结果表明还原型β2-GPI能够抑制CD36mRNA的表达，减少巨噬细胞的脂质摄入，抑制巨噬细胞泡沫化以及细胞凋亡，通过显著抑制p38MAPK的磷酸化活性，降低糖尿病动脉粥样硬化小鼠体内炎症反应，从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。.本项目取得的成果：.1.已发表论著15篇，其中发表SCI论著5篇。3篇英文论著已投稿，另1篇英文论著正在修稿待发表。.2.获得国家发明专利1项。.3.获得天津市科技进步二等奖1项。.4.培养博士研究生