血管内皮细胞分泌、旁分泌功能异常与糖尿病创面愈合障碍的关系及其机制研究

It has been known that vascular endothelial cells (EC) are involved in angiogenesis by the proliferation, migration and budding way, and play a critical role in wound healing. Recently，increasing evidence indicates that it is also a huge glands, regulate the biological behaviour of cells, and maintain the function of organ and tissue in response to external stimulation through secretion, paracrine effect of hormone and growth factors in neighboring cells, which is closely related to the occurrence and development of the disease. Our recent study found that the EC by paracrine mechanism can affect the proliferation and migration of keratinocytes and fibroblasts. However, the relationship between the secretion and paracrine function of EC as well as wound healing remains to be elucidated. In the present project, we will establish EC cultivation system, prepare EC conditioned medium, compare its effect on the biology behavior of cells, which participate in wound repair. the influence of EC secretion and paracrine effect on wound repair will be observed. We will also use exosome blocker to examine the effect of EC secretion and paracrine on wound healing, and explore the role of exosome in secretion and paracrine of EC. The change of the size and content of exosome in diabetic microvascular EC will be examined through the methods such as proteomics. The study will helps to reveal the important role of EC in wound healing, and is likely to provide new information for revealing the mechanism of of healing disorder of diabetic wound.

研究表明：血管内皮细胞（EC）除以增殖、迁移和出芽的方式参与血管新生在创面愈合中发挥作用外，其还是一个巨大的分泌腺，在受到外部刺激时通过分泌、旁分泌激素和细胞因子作用于邻近的细胞，调控其生物学行为，与组织功能的维持、疾病的发生和发展关系十分密切。我们最近的研究发现：EC通过旁分泌机制可影响角质细胞、成纤维细胞的增殖、迁移。然而EC的分泌、旁分泌功能与创面愈合的关系有待于阐明。本立项通过建立EC培养体系，制备EC条件培养基，观察其对参与创面修复的细胞生物学行为的影响，阐明EC分泌、旁分泌功能对创面修复结局可能的影响；利用外泌体阻断剂观察外泌体对EC分泌、旁分泌的影响，探讨外泌体在EC分泌和旁分泌中扮演的角色；通过蛋白质组学方法探索外泌体质和量的变化与糖尿病微血管EC功能损害及创面愈合障碍之间的关系。研究结果有助于深入揭示EC在创面愈合过程中的作用，并有可能为糖尿病难愈创面的治疗提供新的手段。

血管内皮细胞（EC）除以增殖、迁移和出芽的方式参与血管新生在创面愈合中发挥作用外，其还是一个巨大的分泌腺，在受到外部刺激时通过分泌、旁分泌激素和细胞因子作用于邻近的细胞，调控其生物学行为，与组织功能的维持、疾病的发生和发展关系十分密切。我们最近的研究发现：EC通过旁分泌机制可影响角质细胞、成纤维细胞的增殖、迁移。然而 EC的分泌、旁分泌功能与创面愈合的关系有待于阐明。本立项通过建立糖尿病足患者来源的真皮微血管内皮细胞（HDMEC）培养体系，探索糖尿病足疾病状态下人真皮微血管内皮细胞的表型变化和转录水平的改变，并探索其中可能的关键基因；制备EC条件培养基，观察其对参与创面修复的细胞生物学行为的影响，阐明EC分泌、旁分泌功能对创面修复结局可能的影响。在本课题的研究中，基本完成申请书中所列出的研究内容，且获得了新的发现，并作了调整性研究。.研究过程中所取得的主要发现：.1，揭示了EC来源的外泌体对EC和成纤维细胞的生物学功能的促进作用。结合体外和体内实验结果，我们初步认为：EC来源的外泌体可能通过分泌和旁分泌作用影响创面愈合过程。.2，首次利用免疫磁珠分选方法对糖尿病足患者皮肤来源的HDMEC进行分离、培养、鉴定和生物学功能对比。我们发现，糖尿病足溃疡病人皮肤来源的HDMEC成管能力明显受损。.3，转录组测序结果和单细胞测序数据分析结果显示，糖尿病足患者皮肤来源的HDMEC在血管新生上呈显著负性富集。.4，生信分析结果显示，RAB17可能是影响糖尿病足患者来源的HDMEC血管新生的潜在关键基因。敲减RAB17后，HDMEC的成管能力下降。.通过完成本立项研究，我们初步证明EC来源的外泌体分泌和旁分泌功能异常会影响创面愈合过程。通过分离糖尿病足患者皮肤来源的HDMEC，并利用转录组测序结果和单细胞测序数据分析发现，RAB17可能是导致糖尿病足患者来源的HDMEC血管新生障碍的潜在因素之一。本研究的完成初步揭示了糖尿病足患者皮肤来源的HDMEC的功能变化，为进一步研究糖尿病足血管新生障碍提供了新的思路。