亚毫秒级实时三维超分辨显微方法研究及生物应用

Over the past decade, the super-resolution fluorescence microscopy flourished and is widely used in the fields of chemistry, biology, pharmaceuticals, etc. In 2014, the work on the super-resolution microscopy was awarded the Nobel Prize in Chemistry. However, the application of super-resolution technology is still limited in the research fields requiring detecting method with a high spatial and temporal precision, such as the rapid transport of biological molecules and other substances. Aiming at the rapid transportation process in cells, based on the capability of tracking molecules two-dimensionally within sub-millisecond time of a single point edge-excitation sub-diffraction microscopy (SPEED microscope), a second platform will be build up on the microscope to collect the inverted fluorescence signal from the microscope objective and return it to the original detection system. Without prejudice to the plane horizontal resolution, the information of vertical direction could be obtained from the location information of returned signal, to achieve the sub-millisecond three-dimensional super-resolution signal. The 3D SPEED microscopy would be applied on tracking the real-time process of RNA transportation through nuclear pore complex with a high spatial and temporal precision, and study the genetic regulation mechanism of nuclear pore proteins furtherly. This technology will be widely used in various of fast dynamic process studies of biological molecules on the nanoscale, and have important implications on understanding the relationship and their mutual regulation of living systems.

近年来，超分辨荧光显微技术蓬勃发展，广泛应用于化学、生物、医药等一系列领域的研究工作，使之发生了突破性的进展，更于2014年获得了诺贝尔化学奖。但现有超分辨荧光定位技术在需要高空间精度测量的研究中仍存在探测速度局限，尤其是针对生物分子的快速输运过程研究。本项目将针对生物细胞内快速输运问题，在现有单点斜入射快速超分辨显微镜（SPEED显微镜）具有的亚毫秒量级二维探测的技术基础上，搭建显微镜上的第二平台，用来收集反向荧光信号并返还到显微镜原探测系统。在不影响平面横向分辨率的同时，通过从返还信号位置中获取垂直方向信息，实现亚毫秒量级的实时三维空间探测技术。系统开发将与跟踪RNA输出细胞核孔的研究互相印证，通过RNA在细胞核孔各位置上高时空精度的动态过程，进一步研究细胞核孔蛋白调控基因的机理。该技术将可广泛应用在各类生物分子在纳米尺度上快速动态过程研究，对于理解生命体系间相互调控关系有重要意义。

荧光显微镜是现代生物医学研究使用最广泛的工具之一。尽管超分辨显微成像技术已经取得了巨大进步，但是在许多生物课题的研究中，仍存在一定的局限性，面临着诸多挑战。例如：如何进一步提高光子的收集效率，从而提高单粒子的定位精度和显微系统的时空分辨率；如何实现在成像时同步观测单粒子荧光光谱信息等。.本项目针对快速单分子三维追踪的技术问题，建立了一种创新的显微镜架构，主要取得以下研究成果：.1、在不改变点扩散函数形状和平面二维分辨精度的前提下，本项目基于单分子定位，利用双物镜结合凹面镜，搭建了荧光返还超分辨显微系统，从而使得探测器可以同时获得两个成像点。.2、用双物镜荧光返还系统，获得双焦面成像，从而实现三维单粒子追踪。利用该系统的球差特性研究了第一衍射环直径与离焦距离（z）的变化规律，以及系统的三维定位精度；实施了体外和活细胞内的三维单粒子追踪，追踪距离可达5.2 um。.3、通过对荧光返还系统的改进，实现了快速三维单粒子追踪的应用，获得z方向定位精度为10 nm，时间分辨率为0.4 ms。.4、在荧光返还系统的基础上，进一步检测了单粒子荧光光谱，利用多色荧光小球，研究了系统的单粒子光谱校正，并分析单粒子荧光光谱随时间的波动特性。.本项目的研究创新设计了已一套双物镜荧光返还探测的荧光显微镜系统，实现了三个方向定位精度达到10nm，时间分辨率0.4ms，追踪距离5.2 um，为未来在生物系统中快速高精度的定位分子，研究快速生物学过程提供了技术支持。