TGFβ1/Smad2信号通路在应力抑制体外MSCs成脂分化过程中的作用机制研究

骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能，包括向成骨和成脂肪分化，其中初始分化的调控十分复杂，受多种因素影响。一般认为，若要诱导骨髓间充质干细胞向某一种组织分化，则必须同时抑制其向其他的组织分化。机械应力存在一切的机体微环境中，应力刺激对组织、细胞的增殖、分化、衰老都会产生重要的影响。前期实验我们已证明了适当的应力促进体外MSCs增殖以及向成骨细胞分化，并且在脂肪诱导过程中起抑制作用，但细胞响应应力的信号传导以及应力抑制MSCs成脂分化的具体机制尚不清楚，近年报道TGFβ1以及Smad2为MSCs分化调节中的关键转录因子，本实验利用机械应力装置干预体外MSCs，探讨TGFβ1/Smad2信号传导通路在应力抑制MSCs向脂肪细胞分化过程中的作用，旨在为运动疗法在肥胖症及骨质疏松治疗及其机制中提供客观依据和新的理论。

目的：观察周期性牵张应力对MSCs成脂及成骨分化的影响，并探讨TGFβ1/Smad2 信号传导通路在应力调节MSCs向脂肪细胞分化过程中的作用。方法与结果：1、行SD大鼠MSCs的原代培养，并成功进行传代，检测CD29、CD34、CD44、CD45的表型，其表型阳性率分别为93.6%、5.3%、91.4%和4.6%。2、细胞应力干预方法：取足量的3～4代MSCs混合，接种于6孔弹性硅胶膜培养板内培养，将实验组置入美国Flexcell体外细胞力学装置干预。应力大小为5%，每天6小时，10/min，3d或5d，正弦波形。3、检测应力干预MSCs后，对其成骨成脂肪分化的影响：MSCs受应力干预后，成骨指标（Run-X、OSR）基因以及蛋白表达均增高；MSCs受成脂肪诱导剂诱导3、5天，细胞内PPARγ-2 mRNA、adiponectin mRNA、C/EBPα mRNA 表达明显增高，而在诱导过程中，加载应力信号后，此三者的表达明显受到抑制。使用促成脂分化培养基持续培养10d(对照组)，油红O染色胞质内出现被染成橘红色的脂滴颗粒，受到应力刺激（实验组），细胞内脂滴则不明显。4、探讨TGFβ1/Smad2 信号传导通路在应力调节MSCs向脂肪细胞分化过程中的作用。MSCs受成脂肪诱导剂诱导3、5天，细胞内PPARγ-2、adiponectin、C/EBPα mRNA 表达明显增高，而在诱导过程中，加载应力信号后，此三者的表达明显受到抑制；应力作用10min，可以使细胞内实验组TGFβ为对照组的2.99倍；Smad的磷酸化水平增高，实验组增高为对照组的2.43倍，此效应受拮抗剂SB-431542抑制；MSCs在应力干预前，培养基加入激动剂（TGFβ1，4ng/ml），PPARγ-2, adiponectin, and C/EBPα蛋白表达进一步降低，强化了应力的抑制MSCs成脂肪细胞分化的作用；相反，在应力干预前，培养基加入拮抗剂（SB-431542，10μM），PPARγ-2, adiponectin, and C/EBPα蛋白的表达有所回升，抵消了应力对MSCs向脂肪细胞分化的抑制作用。结论：进一步证实应力可抑制MSCs向成脂方向分化，应力抑制MSCs成脂分化的作用依赖TGFβ1/Smad2 信号传导通路。