CaMKII磷酸化4.1N蛋白调控GluR1转运及其分子机制研究

The specific trafficking to postsynaptic membrane of AMPA receptor GluR1 subunit could be a major mechanism of LTP. However, the detailed mechanism of GluR1 trafficking remained to be clarified. Therefore, to study the molecular mechanisms of synaptic plasticity has an important significance. Previous studies have shown that GluR1 phosphorylation and PDZ proteins can regulate AMPA receptor channel characteristics and trafficking, but these are not a sufficient condition of the AMPA receptors on the membrane, suggesting that there are other possible mechanisms regulating the trafficking of AMPA receptor. In this application, we attempt to clarify the LTP process in CaMKII activation contributes to the 4.1N protein Ser/Thr phosphorylation, an increase of CaMKII-4.1N-GluR1-interactions, thus regulating the transport mechanism of GluR1 to the postsynaptic membrane with the integrated use of electrophysiological, western blot, immunoprecipitation, immunofluorescence, cell surface biotin-labeled and live cell station approach, combined with the interference of small peptides, RNA interference machine and molecular cloning experiments in rat hippocampal slices and cultured hippocampal neurons. This study will further reveal the molecular mechanism of AMPA receptor transport from the molecular level.

AMPA受体GluR1亚基特异性的转运至突触后膜是LTP形成的重要机制之一，但其转运机制尚需进一步阐释。因此，研究突触可塑性的分子机制具有重要意义。以往的研究表明，GluR1的磷酸化和PDZ蛋白可以调节AMPA受体通道特性及其转运，但这些并不是AMPA受体上膜的充分条件，提示还有其它的可能机制调节AMPA受体的转运。本申请拟在本人前期研究基础上，以大鼠海马脑片和培养的海马神经元为研究对象，综合运用电生理、免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光、细胞表面生物素标记及活细胞工作站等方法，结合干扰小肽和RNA干扰及分子克隆的实验，试图阐明LTP过程中CaMKII激活促进4.1N蛋白Ser/Thr磷酸化，增加CaMKII-4.1N-GluR1的相互作用，从而调节GluR1至突触后膜的转运机制。本研究将进一步从分子水平揭示AMPA受体转运的分子机制。

长时程增强（LTP）主要是由含有GluA1的AMPAR嵌入突触后膜所引起的，研究证实4.1N蛋白对GluA1的膜转运有重要作用，然而，其在LTP中的作用机制尚未明确。本课题旨在研究 LTP中4.1N蛋白介导AMPAR受体转运机制。我们以海马脑片为研究对象，在Schaffer侧枝给予TBS刺激，采用全细胞记录模式记录CA1区神经元兴奋性突触后电流（EPSC）来观察LTP的产生及变化。给予干扰小肽Tat-GluA1(MPR)(2 μmol/L)干扰4.1N与GluA1的结合和抑制肽Myr-AIP(Myristoylated autocamtide-2 related inhibitory peptide)(1 μmol/L)抑制CaMKⅡ磷酸化来研究4.1N参与LTP的作用机制。采用免疫印迹及免疫共沉淀技术来检测LTP中蛋白质的表达、4.1N蛋白磷酸化及p-CaMKⅡ-4.1N-GluA1的相互结合。结果显示，1. TBS能够诱发CA1区神经元产生LTP，并增加GluA1在突触后膜的表达，给予干扰小肽Tat-GluA1(MPR)能够抑制TBS诱发的LTP维持，并减少GluA1在突触后膜的表达。2. TBS-LTP过程中，CaMKⅡ自身磷酸化抑制肽Myr-AIP抑制TBS-LTP，同时抑制TBS-LTP中CaMKⅡ的磷酸化、GluA1 Ser831的磷酸化及4.1N的丝/苏氨酸磷酸化。3. TBS-LTP增强4.1N与p-CaMKⅡ及GluA1的相互结合，使用Myr-AIP后削弱这一增强效果，并减少GluA1在突触后的表达。4. 鉴定4.1N羧基末端CTD丝／苏氨酸磷酸化位点。这些结果表明：4.1N与GluA1的结合对LTP的维持至关重要，而CaMKⅡ激活能够磷酸化4.1N，增强p-CaMKⅡ-4.1N-GluA1的相互结合及GluA1在突触后膜的表达，从而影响LTP。