糖酵解途径在骨髓间充质干细胞“干性”维持并调控哮喘气道平滑肌细胞自噬中的作用研究

Stem cells have a potential effect on anti-inflammatory and immunomodulatory properties and gradually have been widely used in chronic airway diseases. In our previous experiments, we found mesenchymal stem cells (MSCs) could induce autophagy in airway smooth muscle (ASM) cells, leading to recovery of airway remodeling in asthma. Some studies have indicated that the early asthmatic response is associated with glycolysis and glycolysis correlated to autophagy. We hypothesized that MSCs alleviated airway inflammation and airway remodeling through regulating the autophagy and glycolysis in asthmatic mouse models. In this research, we’ll investigate autophagy levels, glycolysis and cell functions of ASM cells treated by MSCs in the in vitro experiments and elucidate the “glycolysis-autophagy” process involved in the MSCs treatment and the role of wnt/β-catenin signaling pathway in the stemness maintenance. In vivo experiments, we’ll reveal the therapeutic effect of MSCs on autophagy, glycolysis and the proliferation, migration and phenotype modulation of airway smooth muscles and compare the airway inflammation and airway remodeling after the stemness maintenance of MSCs. We intend to apply our scientific achievements to clinical therapy and throw light on asthma therapy.

干细胞具有组织修复和免疫调节作用。干细胞治疗在慢性气道疾病中的作用，是近年来研究的热点。我们前期研究发现，促进气道平滑肌细胞自噬，可以改善哮喘气道重塑。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）起到了促进自噬的作用。有研究表明，哮喘早期反应与糖酵解过程密切相关，而糖酵解过程与细胞自噬互相耦联。因此，我们提出假说：MSC通过调控气道平滑肌细胞自噬，改变糖酵解过程，影响气道平滑肌细胞功能，逆转气道重塑和气道炎症。本课题首先在细胞水平研究MSC对气道平滑肌细胞自噬水平、糖酵解过程和细胞功能的影响，阐明与“糖酵解-自噬”过程和细胞“干性”维持相关的信号通路wnt/β-catenin在MSC治疗中的作用；同时在哮喘小鼠模型中研究MSC治疗对自噬、糖酵解水平和气道平滑肌增生、重塑和表型转化，以及气道炎症和气道重塑的作用，比较“干性”增强前后的差异。将科研成果应用于临床。

目的：支气管哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，以气道高反应性、气道炎症和气道重塑为特征。本研究拟研究间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）来源的外泌体在哮喘气道重塑中的作用及其潜在机制，为气道重塑寻找新的治疗方法。.方法：在哮喘气道平滑肌细胞中，用PCR和Western blot法检测自噬与糖酵解的关系。超速离心法和试剂盒法结合提取MSC来源的外泌体，构建慢性哮喘小鼠模型，分别在激发前及反复激发后滴鼻干预MSC-exo。通过HE染色、PAS染色、ELISA实验评估气道炎症水平，masson染色和免疫组化染色评估气道重塑水平；体外实验将MSC-exo干预哮喘人支气管平滑肌细胞（asthmatic human bronchial smooth muscle cells, BSMCs），用CCK8、Transwell实验、划痕实验和Western Blot等方法检测细胞活力、迁移能力、BSMCs自噬水平和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。 qRT-PCR筛选出MSC-exo干预后BSMCs内差异表达最高的miRNA分子miR-145-5p，qRT-PCR检测MSC-exo内miR-145-5p的表达，生物信息学预测并荧光素酶报告基因验证下游靶基因KLF4。.结果：体外实验MSC-exo干预BSMCs后，可抑制BSMCs的细胞活力、迁移能力、抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达和提高BSMCs自噬水平。MSC-exo干预后BSMCs miR-145-5p水平显著提高，荧光素酶报告基因验证miR-145-5p和靶基因KLF4相互结合。体内实验，与慢性哮喘模型小鼠相比，NC mimic-MSC-exo和miR-145-5p mimic-MSC-exo均可抑制慢性哮喘模型小鼠气道炎症细胞浸润、粘液细胞增生和分泌、BALF和血清中炎症因子水平；降低气道上皮下胶原纤维沉积和α-SMA 、Collagen I表达；抑制肺组织KLF4蛋白和PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达，同时提高肺组织自噬水平。.结论：MSC-exo通过携带并释放miR-145-5p至BSMCs，负向调节KLF4水平的表达，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制BSMCs的增殖和迁移能力，缓解慢性哮喘小鼠气道炎症和气道重塑。