两种地胆草属植物中咖啡酸衍生物抗呼吸道合胞病毒的作用机制及构效关系研究

Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the most common respiratory infection viruses, however, there is no specific and effective methods for the treatment and prevention of RSV infection so far. Our previous studies revealed that the caffeic acid derivatives from Elephantopus scaber and Elephantopus mollis possessed good in vitro and in vivo anti-RSV activities. Among the active compounds, dicaffeic acid derivatives displayed the best effect. It is noteworthy that dicaffeoyl cyclopentan-3β-ol (a new compound) possessed much more potent anti-RSV activity than ribavirin (the positive control) with lower cytotoxicity and higher selective index (SI). Preliminary mechanism research indicated that under the non-toxic concentration, dicaffeic acid derivatives not only could inhibit RSV fusion into host cells, but also could maintained their inhibitory effects in the later phase of RSV replication cycle. The results suggested that caffeic acid derivatives might be a kind of anti-RSV agents with multi-targets, pointing the viral proteins. Accordingly, the present study will be conducted to (1) further isolate and identify the caffeic acid derivatives from two species of Elephantopus L., and evaluate their anti-RSV activity, and (2) investigate the structure-activity relationship (SAR) of the caffeic acid derivatives, and (3) explore the anti-RSV mechanism in the cell culture and molecular levels. The study of the project will provide the scientific support for developing the safety and effective new antiviral agents.

呼吸道合胞病毒（RSV）是除甲型流感外最常见的呼吸道感染病毒，目前尚无特异有效的治疗和预防方法。我们的前期研究发现，地胆草和白花地胆草中的咖啡酸衍生物具很好的体内、外抗RSV活性，其中双咖啡酸衍生物的活性最好。特别是，新化合物双咖啡酰环戊三醇的活性优于阳性对照药利巴韦林，而且，由于该化合物的细胞毒性低，其抗病毒选择性指数为利巴韦林的十几倍。初步的机理研究表明，在完全无毒浓度下，双咖啡酸衍生物既能在病毒感染早期抑制RSV与宿主细胞的融合，又可抑制RSV进入细胞后的复制过程，因此推测该类化合物是一类多靶点的RSV抑制剂，且作用机制与细胞毒性无关，其作用靶点可能为病毒蛋白。本项目拟在前期工作基础上，进一步分离和富集两种地胆草属植物中的咖啡酸衍生物，评价不同结构的咖啡酸衍生物对RSV的抑制作用，并对其作用靶点和构效关系进行深入研究，为研究和开发高效、低毒、作用机制新颖的抗病毒药物提供科学依据。

本项目主要从以下几个方面开展研究，研究地胆草属植物中咖啡酸衍生物抗呼吸道合胞病毒的作用机制及构效关系：.（1）本项目运用多种分离技术对地胆草、白花地胆草等中草药进行了系统的化学成分分离，从中获得了一系列咖啡酸衍生物，为后续的抗呼吸道合胞病毒研究提供丰富的样品；同时对分离得到的部分咖啡酸衍生物进行了初步的抗RSV活性筛选，结果显示，大部分咖啡酸衍生物对RSV显示出不同程度的体外抑制活性，并且一些咖啡酸衍生物的抗RSV活性优于阳性药利巴韦林。.（2）应用HPLC法，对15批不同来源的地胆草药材的指纹图谱进行了研究，建立了地胆草药材HPLC 指纹图谱；利用化学对照品的方法对主要色谱峰进行了确认；对活性成分含量进行测定。该方法准确稳定，可靠性良好，可以更好的鉴定地胆草药材的真伪优劣，为地胆草质量控制提供依据。.（3）对3,4-双咖啡酰基奎宁酸甲酯（3,4-DCQAME）进行体内活性研究，空斑测滴度实验结果显示3,4-DCQAME能显著抑制小鼠肺组织中的RSV滴度，并呈现明显的剂量依赖性，能显著降低RSV感染后肺部 F 蛋白的表达；对小鼠肺部切片进行HE染色，结果表明3,4-DCQAME 能显著缓解RSV 感染引起的肺部炎症，体内实验表明，3,4-DCQAME 在体内也有较高活性，能显著缓解 RSV 感染后小鼠肺部病变程度，降低小鼠肺部病毒滴度。.（4）通过病毒蛋白荧光定量检测、蛋白免疫印迹实验、激光共聚焦实验、VOPBA 实验免疫共沉淀实验等分子生物学实验，对3,4-DCQAME抑制RSV-F蛋白的体外作用机制进行深入研究。实验结果表明，在RSV病毒进入宿主细胞前给药，3,4-O-DCQAME可显著降低F蛋白的表达，并且还可抑制F蛋白与其宿主细胞表面受体（如核仁素）的结合。由于F 蛋白与宿主细胞表面的接触由其F1亚基介导，我们推测3,4-O-DCQAME可能首先作用于F蛋白的F1亚基，继而干扰了F蛋白与其细胞表面受体的结合。体外和体内实验结果均表明3,4-DCQAME 几乎无毒性，而阳性药利巴韦林毒性较大。. 我们的研究首次发现咖啡酸衍生物能够抑制病毒 F 蛋白介导的穿入过程，推测其作用靶点可能是 F 蛋白，从而抑制 F 蛋白与细胞膜的结合。目前，我们在国内外期刊上发表论文24篇，其中SCI论文13篇。培养博士研究生1名（在读），硕士研究生6名（3名已毕业，3名在读）。