猪小肠NPT-IIb调控蛋白的筛选与鉴定

动物对磷的吸收主要通过顺浓度梯度的被动扩散和载体蛋白的主动运输两种方式进行。钠磷协同转运蛋白-IIb（NPT-IIb）是动物小肠中唯一被发现的参与无机磷吸收的载体蛋白；已有对不同动物的研究表明，许多蛋白因子（代谢酸素激酶、核酸因子1、糖皮质激素依赖激酶1等）参与对小肠NPT-IIb蛋白的调控；本项目的前期研究也检测到表皮生长因子对猪小肠上皮细胞NPT-IIb蛋白表达的影响，由此推断：以NPT-IIb为靶蛋白，以相关蛋白为调控子的调控体系可能是动物小肠磷吸收发生过程中重要的调控途径。本项目旨在以生长猪小肠上皮NPT-IIb相互作用蛋白筛选为研究切入点，采用免疫组化、RT-PCR、RNA干扰等技术和方法，明确生长猪小肠NPT-IIb调控蛋白类型，揭示其生理功能以及与小肠磷吸收的关系，本项目的完成将为动物磷利用的调控和低磷日粮的配制提供理论依据。

动物对磷的吸收主要通过顺浓度梯度的被动扩散和载体蛋白的主动运输两种方式进行。钠磷协同转运蛋白-IIb（NPT-IIb）是动物小肠中唯一被发现的参与无机磷吸收的载体蛋白，但猪小肠NPT-IIb基因分子特性，调控机理尚不清楚。本项目采用免疫组化、RT-PCR、RNA干扰等技术，结合生物信息学分析方法，研究了猪小肠NPT-IIb基因的功能特性，影响NPT-IIb表达的因素及调节NPT-IIb表达的信号通路，并以鸡及大鼠为模型动物研究了磷水平及不同肠段对NPT-IIb表达的影响。研究结果：（1）成功克隆了猪小肠NPT-IIb基因全长cDNA序列，并递交NCBI获得序列号（NM_001256772.1），生物信息学方法分析表明：猪NPT-IIb基因全长cDNA序列由2571bp核苷酸组成，有一个完整的2016bp开放阅读框，编码相对应的671个氨基酸，包含157bp 5’-UTR区和398 bp的3’-UTR区。（2）猪小肠NPT-IIb表达具有组织差异性，在肺、小肠、肾脏、卵巢、胎盘、肝脏、胸腺、乳腺及下颌腺表达较高，但不同肠段NPT-IIb表达无显著差异，而鸡小肠中十二指肠NPT-IIb表达量最高。（3）雌激素、糖皮质激素、神经肽Y、降钙素、降钙素基因相关肽及日粮磷水平等对猪NPT-IIb的表达具有调节作用。高浓度雌激素（1×10-7µg/mL）增加了NPT-IIb mRNA表达量，糖皮质激素抑制NPT-IIb mRNA表达，适宜浓度的神经肽Y可刺激小肠上皮细胞NPT-IIb mRNA及NPT-IIb蛋白的表达，降钙素对NPT-IIb的表达无显著影响，降钙素基因相关肽在一定浓度范围内能促进NPT-IIb表达，进而调节钠依赖型磷的吸收，低磷日粮可促进鸡及大鼠小肠NPT-IIb表达。（4）PI3K/mTOR信号通路参与雌激素对NPT-IIb基因的调控。本项目的成功实施，揭示了NPT-IIb的生理功能、调控机制及其与小肠磷吸收的关系，为调控动物磷利用和低磷日粮的配制提供理论依据。