EGF对猪小肠磷吸收通道蛋白NPT-IIb调控的分子机制

Excessive emissions of phosphorus in animal husbandry is the major cause of resource waste and environmental pollution, and investigating phosphorus absorption and regulation mechanism clearly is one of point of penetration to solve this problem. Type IIb sodium dependent phosphate cotransporters (NPT-IIb) is the only identified carrier protein in intestine involved in inorganic phosphorus. Epidermal growth factor (EGF) inhibited phosphorus reabsorption through decreasing the expression of human and rats intestinal NPT-IIb mRNA, and PKC/PKA and MAPK signal pathways may be involved in the regulation process. How to EGF regulate the utilization of phosphorus through NPT-IIb in porcine intestine, and which pathways involved in signal transduction have not been reported . Therefore, this project hopes to use porcine cell culture and EGF hormone treatment to determined function sites of EGF on NPT-IIb promoter region; then, through treatment with appropriate inhibitor, combine with western blot and fluorescent quantitation PCR technology, to investigate the molecular mechanism and pathway of EGF in NPT-IIb regulation, to lay a theoretical foundation for further elucidating the molecular mechanism and transduction of porcine intestinal phosphorus absorption.

养殖业中磷的过量排放，是造成资源浪费和环境污染主要原因，探明磷吸收与调控机理是解决该问题的突破口。钠磷协同转运蛋白-IIb（NPT-IIb ）是动物小肠中唯一被发现的参与无机磷吸收的载体蛋白。表皮生长因子（EGF）通过降低人和大鼠肠道NPT-IIb mRNA的表达而抑制对磷的重吸收，PKC/PKA和MAPK信号通路可能参与此调控过程。EGF如何通过NPT-IIb调控磷的利用，其信号转导通路有哪些，未见报道。因此，本项目拟采用猪小肠细胞培养和EGF激素干预处理，探明NPT-IIb启动子作用区域，再通过适宜的抑制剂处理，结合蛋白质免疫印迹和荧光定量PCR技术，探讨EGF对NPT-IIb调控的分子机制及其通路，为进一步阐明猪小肠磷吸收的分子机制奠定理论基础。

钠磷协同转运蛋白-IIb（NPT-IIb）是动物小肠中唯一被发现的参与无机磷吸收的载体蛋白，前人研究表明表皮生长因子（EGF）对人结肠癌细胞（Caco2）及大鼠肠道NPT-IIb具有调控作用。本项目主要聚焦EGF对猪小肠上皮细胞NPT-IIb表达调控的作用机制。研究内容包括两个部分：（1）EGF响应元件在NPT-IIb启动子作用位点的区域鉴定。研究以猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，通过生物信息学预测、双荧光酶检测、免疫共沉淀、电泳凝胶迁移、基因突变技术和方法鉴定EGF响应元件在NPT-IIb启动子作用位点的区域。（2）EGF调控猪小肠上皮细胞NPT-IIb表达的分子机制。前期通过预备试验，研究了mTOR信号通路对NPT-IIb分子的调节，摸索了分子机制研究的方法，在此基础上，采用相应的信号通路抑制剂（EGFR、PKA、PKC、MAPK/p38、MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK抑制剂）研究EGFR、PKA、PKC、MAPK/p38、MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK信号通路对NPT-IIb表达的影响。研究结果：（1）生物信息学预测结果表明，c-myb在NPT-IIb基因的启动子-1500～-1 bp 之间存在10个潜在的结合位点，通过双荧光酶检测、免疫共沉淀、基因突变技术发现EGF作用NPT-IIb启动子位点位于-1092～-1085 bp区域（5’-TCCAGTTG-3’）；（2）mTOR信号通路参与雌激素对NPT-IIb的表达调节，且随着时间的延长其蛋白表达呈现先升高后降低的趋势；EGF抑制IPEC-J2细胞NPT-IIb的表达，且与EGF浓度成正相关；EGFR、PKA、PKC、MAPK/p38、MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK的特异性抑制剂处理IPEC-J2细胞后，NPT-IIb表达水平均显著提高，表明EGF通过EGFR，PKA，PKC，p38，ERK，JNK的介导作用，下调了IPEC-J2细胞中NPT-IIb的表达。本项目研究成果探明了EGF响应元件作用NPT-IIb启动子位点区域，从分子机制上揭示了EGF对NPT-IIb的调控作用，为诠释猪小肠磷吸收的分子机制、提高磷资源的利用效率、降低磷排放对环境的污染提供了科学依据。