产甲烷条件下互营烃降解菌Syntrophus sp.的定向分离及其烃降解基因研究

This proposal will try to sequence the genomic DNA of the methanogenic hexadecane-degrading consortium, and construct whole genome of Syntrophus sp. using metagenomic technique. The pathway of carbon metabolism of Syntrophus sp. will be deduced based on bioinformatics anaysis, and genes related with hydrocarbon degradation will be proposed, which will be further checked using RNA-seq and qPCR methods. The understanding will provide basis for the isolation of syntrophic hydrocarbon degrader Syntrophus sp...

利用厌氧微生物菌系，将油藏中残留的原油转化为甲烷，进行气态开采的技术(油藏变气藏)，是未来低品位油藏开发的新方向。国内外研究发现未培养Syntrophus spp.分布广泛在油藏环境中，推测在烃降解过程起重要的生态学功能。我们利用稳定同位素探针技术，证实其中一类Syntrophus sp.是产甲烷条件下互营降解正十六烷烃的关键细菌类群。本项目拟通过宏基因组测序，获得正十六烷烃降解产甲烷菌系中的总DNA序列，利用单基因组拼接技术获得Syntrophus sp.的全基因组序列，进而利用生物信息学方法推测其碳代谢途径与烃降解相关的功能基因；通过RNA-seq和定量PCR技术，筛选、验证Syntrophus sp.的碳代谢与互营烃降解基因，从而为进一步指导Syntrophus sp.的定向分离研究提供基础。

本项目只获得的了一年资助，而菌系的培养期要半年以上，因此难以按照原计划开展定向分离工作。我们调整采用高通量测序和宏基因组分析，拟拼接出未培养互营烃降解菌的全基因组序列，通过生物信息学分析，研究互营烃降解菌的遗传学特征，从而为定向分离互营烃降解菌提供指导，这样的调整得到了NSFC的认可。取得研究结果如下：.1. 通过宏基因组法拼接获得了未培养互营烃降解菌的基因组序列：利用40 Gb的DNA序列，组装获得144,759个scaffolds。拼接出一个scaffolds丰度在3000以上，GC含量约43%的draft genome，其基因组的完整度大于97%。PCA分析scaffolds的四核苷酸酸多态性，并剔除了离散分布的低质量片段。获得的draft genome为2.8 Mb，GC含量约42.8%，菌株命名为M82_1。.2. 基于生物信息学分析获得了未培养互营烃降解菌的基因特征：注释出M82_1的基因组有2815 ORFs，具有不完整的EMP、磷酸戊糖和TCA途径。M82_1具有完整的长链脂肪酸和丁酸的beta氧化途径，但降解丙酸和乙酸的途径不完整。M82_1中也发现了编码alkylsuccinate synthase基因，表明M82_1是通过延胡索酸激活来启动正十六烷降解的。绘制出了M82_1的细胞代谢网络图，并将这个菌所代表的新种命名为Candidatus Smithella cisternae。目前正在撰写论文1篇。.3. 发现了互营烃降解菌Syntrophaceae的生理生态学特征：发现互营烃降解菌M82_1能降解长链二元酸，培养周期可缩短到70余天，研究结果发表在《微生物学报》上。发现属于Syntrophaceae的互营烃降解菌可分为三大类，研究结果已经被Microbial ecology接受。.4. 不足之处：未按照项目任务书开展“通过RNA-seq和定量PCR技术，筛选、验证Syntrophus sp.的碳代谢与互营烃降解基因”。2013年国外小组通过单细胞测序获得了另外一个互营烃降解菌的基因组草图，并完成了RNA-seq工作，但是没有注释出assA基因。2014年加拿大科学家重新分析了他们的数据，并证实了存在aasA基因。我们在M82_1中也发现了一个类似的assA基因，通过中间代谢产物分析也证实了延胡索酸的起始降解机制，所以这个工作没有继续往下做。