半滑舌鳎雄性化关键基因的筛选和功能分析

鱼类性逆转是近年来发育生物学研究热点之一。本项目组前期研究发现半滑舌鳎存在自然性逆转现象，导致实际生产中雄性化率过高，由于雄性生长显著慢于雌性，严重影响半滑舌鳎产业的规模化发展。因此，本项目拟以半滑舌鳎为研究对象，在前期建立的性腺发生和分化模式基础上，采用基于Solexa 高通量测序的mRNA表达谱差异分析技术对半滑舌鳎未分化性腺和伪雄鱼性腺进行差异表达基因的筛选，采用real-time PCR 建立差异表达基因在半滑舌鳎性腺发育模式下的表达图式，筛选雄性化关键基因，利用精子介导转染技术过表达（沉默）关键基因，分析关键基因与其它相关基因的表达调控关系，验证关键基因表达的剂量敏感效应，探讨通过基因调控实现性逆转的机制，为阐明半滑舌鳎雄性化基因调控网络奠定基础。

鱼类性逆转是发育生物学研究热点之一。前期研究发现半滑舌鳎存在天然性逆转现象，导致实际生产中雄性化率过高，由于半滑舌鳎雄性生长显著慢于雌性，严重影响半滑舌鳎产业的规模化发展。本研究以半滑舌鳎雄性化现象为切入点，针对伪雄鱼、正常雄鱼和雌鱼开展高通量转录组测序，分别获得1.07 Gb, 1.26 Gb和1.25 Gb有效数据。以半滑舌鳎基因组为参考序列，对转录组数据进行基因注释和功能富集，筛选性逆转相关基因。克隆和表征了参与半滑舌鳎性逆转的7个重要基因（dmrt1、cyp19a1a、dax1、amh、sox9a、gsdf和figalpha），初步绘制了半滑舌鳎生殖系从原始生殖细胞（PGCs）的发生到两性配子的早期性腺发育基因调控通路。从半滑舌鳎BAC文库中筛选dmrt1、cyp19a1a和sox9a基因阳性克隆，完成其中4个BAC克隆的测序、拼接和基因组结构解析，组装长度分别为145,278 bp、165,379 bp、107,567 bp和127,603 bp。重点分析了含有cyp19a1aBAC克隆的基因组结构特征，该BAC序列GC含量为 43.44%，转座元件占全长序列的4.38%，注释基因9个。比较基因组分析表明cyp19a1a在不同鱼类具有保守的内含子和外显子结构、5个功能域以及基因共线性。开展了半滑舌鳎dmrt1基因转染和RNAi研究。利用构建的pVASA-Ndmrt1和pVASA-Fdmrt1-gfp载体转染精子，与正常卵子受精后，检测获得16%的阳性鱼苗。利用构建的4个dmrt1 miRNA载体分别与pCS2cherry-dmrt1在大菱鲆肾细胞系中进行共转染，筛选到4号位点具有较好抑制效果。利用转录组分析鉴定出figalpha基因存在2种可变剪切形式，其中一种在伪雄鱼精巢特异表达，另一种在正常雌鱼卵巢高表达，研究表明在雌鱼卵巢和伪雄鱼精巢间不同剪切形式的选择是由于可变第一外显子的甲基化程度造成。利用转录组分析表明半滑舌鳎伪雄鱼Z染色体整体缺失剂量补偿机制，但存在特异的剂量补偿区域，该区域的剂量补偿是通过上调伪雄鱼的基因表达来实现的。总之，本研究对半滑舌鳎性逆转关键基因进行表征和功能分析，初步绘制了半滑舌鳎性逆转基因调控通路，为半滑舌鳎性逆转分子机制的解析奠定了基础，同时也为半滑舌鳎高雌苗种培育技术的建立提供了理论依据。