半滑舌鳎性别决定基因筛选和功能分析及性别决定机制研究

鱼类性别决定基因的筛选和性别决定机制的阐明始终是国际上亟待攻克的重要科学问题。选择适合的实验材料是攻克这个问题的关键。半滑舌鳎是我国重要海水养殖鱼类，具有雌性比雄性个体大、雌性具有大的异型W染色体、养殖群体中存在少量自然性反转的伪雄鱼等特点。因此，半滑舌鳎是筛选性别决定基因、研究鱼类性别决定机制的理想模型。本项目将在完成了半滑舌鳎全基因组测序并初步获得雌性特异候选基因的基础上，通过高密度遗传连锁图谱和性染色体物理图谱构建以及染色体FISH杂交等研究性别决定候选基因的染色体定位及其起源和演化；通过RNA干扰、基因转移和表达模式及其调控网络分析等研究性别决定候选基因的功能；通过伪雄鱼及其后代全基因组甲基化分析揭示自然性逆转的表观遗传学调控机制，最终阐明半滑舌鳎性别决定和雌雄生长差异的分子机制。本项目不仅对于鱼类性别决定机制的研究具有重要科学意义，而且对于半滑舌鳎全雌苗种的培育具有重大应用价值。

半滑舌鳎是我国特有的海水鱼类，其雌雄生长差异巨大限制了养殖业的可持续发展。本项目以半滑舌鳎为研究材料，绘制了世界上首个比目鱼类染色体图谱，构建了半滑舌鳎Z、W性染色体序列图谱，揭示出半滑舌鳎性染色体与鸡的趋同进化现象。构建完成半滑舌鳎高密度SSR图谱，共定位1009个标记。构建半滑舌鳎第一代物理图谱，将29709个克隆装配到1485个重叠群中，物理图谱总长度估算为797MB，实现了半滑舌鳎物理图谱和高密度遗传连锁图谱的整合。首次发现Dmrt1为半滑舌鳎Z染色体连锁、雄性特异表达和精巢发育必不可少的关键基因。建立了半滑舌鳎胚胎显微注射技术和基因组编辑技术，获得了Dmrt1 TALEN敲除后生长较快的雄鱼，开辟了基因组编辑育种的新途径。克隆和表征了半滑舌鳎neurl3、tesk1、piwil2等近20个性别决定及性腺发育相关基因，揭示了W染色体上neurl3基因的缺失可能是导致W精子难以成活的原因之一。鉴定出CSW1-4等4个W染色体特异候选基因，其中CSW1和CSW2在卵巢中高表达，其重组产物都有上调雌性相关基因和下调雄性相关基因的活性。首次绘制了国际上第一张非模式脊椎动物的单碱基分辨率甲基化图谱，证实半滑舌鳎性逆转过程中甲基化模式的改变可以遗传给下一代。以半滑舌鳎雌雄个体的生长-生殖轴主要组织进行了转录组分析，为深入揭示雌雄生长性状差异分子机制奠定丰富数据基础。建立半滑舌鳎性腺、脑等多个细胞系，为功能基因组学研究提供便利细胞平台。首次揭示了半滑舌鳎养殖苗种中雄鱼比例高、雌鱼比例低的奥秘，创建了半滑舌鳎高雌苗种制备技术，将半滑舌鳎生理雌鱼比例提高了20%以上。本项目相关结果已获2014年度国家技术发明二等奖1项，发表研究论文48篇，其中在Nature Genetics、Genome Research、Scientific Reports等杂志发表SCI文章27篇，申请国家发明专利10项，其中授权发明专利7项。本项目的实施已将我国鲆鲽鱼类基因组和性别调控机制研究提升至国际领先水平，促进了我国鱼类基因组学科及鱼类基因组编辑育种的发展。