携带HBV基因的不同血清型腺相关病毒对慢性乙肝病人树突状细胞的免疫刺激

慢性乙肝患者免疫障碍的主要原因之一是树突状细胞抗原递呈功能缺陷。我们的前期研究首次报道了通过2型腺相关病毒（AAV）载体携带乙肝病毒（HBV）基因可以刺激树突状细胞，特异性杀伤HBV感染的靶细胞。但困扰2型AAV载体的问题是其对树突状细胞的转化率不高。因此本研究一方面拟利用其他型AAV载体（AAV-1，5，6，8），制备携带报告基因及HBV抗原的AAV重组病毒，与2型AAV比较，观察其对树突状细胞的转导效率、抗原表达和特异性细胞毒杀伤作用。另一方面，我们在预实验发现两株可能的新型AAV基础上，继续从AAV丰度高的人体组织中利用保守序列扩增、测序和中和抗体等方法筛选新的AAV类型,与现有血清型比较对树突状细胞的刺激。第三利用流式细胞仪和荧光素标记等方法，探讨不同AAV血清型影响树突状细胞表面分子、受体和进入细胞过程等方面的机理。本课题旨在为改良AAV载体提高对乙肝免疫杀伤作用提供实验依据。

慢性乙肝免疫耐受的原因之一是患者体内树突状细胞（DC）抗原提呈功能缺陷。本研究首先从慢性乙肝病人血清和肝组织中利用保守序列扩增、测序和中和抗体检测等方法筛选新的AAV类型,发现2例与其他已经报道的病毒同源性相差20%以上，提示有可能是新型AAV。 第二，以新型AAV的包装蛋白cap构建辅助质粒，与现有常用血清型AAV－1，2，5，6，8载体比较，制备携带报告基因及HBV抗原包装成新型AAV重组病毒。将重组AAV/HBV分别感染从慢性乙肝病人和健康人外周血中分离出的单核细胞。感染后的单核细胞在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下继续培养7天获得成熟的DC。用RT-PCR及流式细胞仪细胞内染色分别检测HBV基因的RNA和蛋白在DC的表达，其中AAV-2/HBV和AAV-8/HBV病毒对DC的感染效率最好，在80-90%左右。第三，将同一个体的DC与T细胞混合培养制备成效应细胞CTL，观察CTL对HBV感染的靶细胞的细胞毒杀伤作用。实验结果表明AAV-2和AAV-8携带的/HBV-S, C 或X 刺激DC后均可以产生明显的抗原特异性的细胞毒杀伤，CTL杀伤率均在30-50%左右，明显高于对照组。同时特异性的CTL杀伤反应可以被MHC-I型抗体所阻滞，提示此种特异性的CTL反应主要通过MHC-I型抗原介导。 最后，检测了不同AAV类型在整合和影响树突状细胞表面分子等方面的机理。发现了AAV可以与宿主染色体整合，提高CTL干扰素γ表达。. 在本研究中我们应用AAV为载体的重组病毒，将其分别带有HBV的S、 C或X基因，分别转化刺激人外周血培养的DC，观察感染转化效率和抗原的表达，以及由DC提呈抗原引起的特异性的CTL杀伤作用，并优化条件初步用于慢性乙肝病人体外培养的细胞，为进一步临床应用于慢性乙肝病人提供研究基础。