DNA修复基因Fance缺陷小鼠卵巢卵泡储备池的形成障碍机制研究

Diminished follicular reserve pool is the key event leading to premature ovarian insufficiency（POI）. However, the study of its formation mechanism lags behind. In this project, DNA repair gene Fanconi anemia group E（Fance） deficient mice were constructed for the first time. Female Fance deficient mice showed the declining follicle reserve pool, impaired reproductive capacity and the appearance of POI phenotype. Based on these research results, we hypothesize that rapid growth of germ cells leads to DNA damage in embryonic stage of primordial follicle formation, if not timely repair will result in genomic instability and promote the damaged primordial follicles to selective apoptosis, so as to ensure the stability of follicular genome in the ovarian reserve pool. To confirm this hypothesis and to study the mechanism of the decrease of follicular reserve pool in Fance mutant mice, we will analyze the effects of DNA damage on the proliferation and differentiation of germ cells at different time points in the rapid growth period, and quantitative changes of egg cells with genomic instability at each time point in rapid reduction period. At the same time, female germ cells from human embryos and fetuses will be tested. Through the completion of this project, we hope to investigate the role of Fance gene in the formation of follicular reserve pool，and to establish the theory of selection of the follicle with stable genome in the formation of ovarian follicle reserve. This will provide a new theoretical basis for the study of ovarian function.

卵泡储备池的减少是导致早发性卵巢功能衰退（POI）的核心事件，但其形成机制的研究滞后。本项目组首次构建了DNA修复基因范可尼贫血基因E（Fance）缺陷小鼠，在前期研究发现其卵泡储备池减少、生殖能力下降及出现类似人POI表型的基础上，提出胚胎期原始卵泡形成时快速生长出现DNA损伤，若不能及时修复将导致基因组不稳定，促使损伤的原始卵泡选择性凋亡，从而确保进入储备池的卵泡基因组稳定的假说。为证实这一假说并研究Fance突变鼠卵泡储备池的减少发生机理，我们将分析在快速生长期各时点DNA损伤对生殖细胞增殖和分化的影响，在快速减少期各时点基因组不稳定卵细胞的数量变化，同时以人胚胎和胎儿的雌性生殖细胞进行验证。通过本项目的完成，我们希望在深入探讨Fance基因与卵泡储备池的形成作用的同时，建立卵泡储备形成的基因组稳定卵泡的选择理论，为卵巢功能研究提供全新的理论依据。

课题以Fance基因突变的FVB/N小鼠为研究对象，建立了早发性卵巢功能衰退（POI）的小鼠模型，采用HE染色、免疫组化、免疫荧光双染、TUNEL染色、单细胞测序等技术研究Fance对胚胎期雌性小鼠生殖细胞发育的影响。实验结果：.FVB/N野生型小鼠生殖嵴在胚胎期13.5dpc时发育为卵巢；在卵巢储备形成过程中，卵巢逐渐发育，体积增大。皮质和髓质卵巢在E17.5时明显区分。生殖细胞数量和多能性在13.5dpc达到峰值，然后在减数分裂期间下降。DNA双链断裂（DSBs）的形成在生殖细胞减数分裂期间显着增加，在此期间由同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）修复不断修复DSBs。增殖和凋亡的生殖细胞在减数分裂期间很少观察到。（2）Fance-/-小鼠的雌性生殖细胞在胚胎期13.5dpc至出生后2dpp的减数分裂期数量显著减少；Fance缺陷导致出生前后生殖细胞的多能状态和DNA损伤修复异常，不影响该发育阶段生殖细胞的增殖和凋亡。（3）Fance-/-小鼠的生殖细胞在胚胎期9.5dpc至12.5dpc的原始生殖细胞发育阶段数量显著减少；Fance缺陷导致其原始生殖细胞的凋亡增加、有丝分裂阻滞、DNA损伤的累积，不影响表观遗传重编程过程。转录组测序得到9.5dpc、12.5dpc Fance-/-和Fance+/+小鼠原始生殖细胞的差异表达基因集，以及对相关信号通路、调控基因的预测和分析，揭示了Fance缺陷小鼠生殖细胞发育障碍的潜在机制。综上研究证实，Fance基因通过增加胚胎早期原始生殖细胞的凋亡、有丝分裂阻滞和DNA损伤导致原始生殖细胞数量减少，同时影响出生前后生殖细胞的多能状态和DNA损伤的修复，最终导致卵泡储备池的形成障碍。转录组测序结果也将为生殖细胞发育和Fance基因功能研究提供有力证据。