基于HPA轴的HSP70对冷应激大鼠炎症细胞因子的调控机制

冷应激可导致动物机体免疫力下降，使畜禽发病率和死亡率升高，给寒区畜牧业造成巨大损失，故研究冷应激动物免疫力低下的机理具有重要意义。我们前期的研究表明，冷应激猪炎症相关细胞因子的变化与热休克蛋白（HSP70）相关。本项目利用基因重组、Western Blot、实时荧光定量PCR、酶联免疫斑点检测和受体放射分析等技术，检测静脉注射HSP70基因真核表达载体对冷应激大鼠血清炎症相关细胞因子（IL-2、TNF-α、IL-4和IL-6）水平、ACTH与GCs浓度、淋巴细胞HSP70表达量、ACTH-R和GR及其mRNA的表达水平、两种激素与相应受体亲和力的影响。从分子水平上探讨HSP70对冷应激大鼠血清炎症相关细胞因子、ACTH-R和GR等的影响，为揭示冷应激对动物机体免疫机能影响的机制提供理论依据，同时可望为动物和人类应激相关疾病的防治提供重要的医学参考。

本研究以12周龄SPF级Wistar大鼠作为研究对象，采用基因重组技术构建介导HSP70的重组腺病毒表达质粒，纯化高滴度介导HSP70的重组腺病毒。按照不同病毒量和感染时间，尾静脉注射纯化后的重组腺病毒pAd-CMV-HSP70。通过qRT-PCR及western blotting方法检测大鼠体内各组织HSP70的表达情况，筛选最佳病毒感染量及感染时间。.将大鼠随机分为空白组（单纯进行冷刺激）、介导HSP70的重组腺病毒质粒感染组以及重组腺病毒空载体质粒感染组；上述三个试验组分别设定：常温组（非冷刺激组）、急性冷刺激组、慢性冷刺激组。急性冷刺激组又分为三组，分别给予时间为6 h、12 h、24 h的冷刺激；慢性冷刺激也分为三组，分别给予时间为6 d 、9 d、12 d的冷刺激；将空白对照常温组设为对照组。每组10只大鼠。按照最佳病毒感染量及感染时间作用于大鼠后，进行冷刺激试验。冷刺激试验均在智能人工气候室进行。正常饲养温度为24 ± 0.05 ℃，冷刺激温度4 ± 0.05 ℃。冷刺激后，收集大鼠血液分离血清和淋巴细胞。采用Luminex液相芯片及ELISA技术检测大鼠血清内炎症相关细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10和趋化因子IP-10）、应激激素（ACTH、皮质酮）的动态变化。采用qRT-PCR及western blotting 方法检测冷应激大鼠淋巴细胞中HSP70、促肾上腺皮质激素受体（ACTHR）、糖皮质激素受体（GR）mRNA及蛋白水平的动态变化。.结论如下：腺病毒介导的HSP70在肝脏、脾脏组织过表达后，可提高大鼠机体对急性应激的保护作用，主要通过抑制冷应激大鼠促炎症细胞因子TNF-α、IL-6的分泌，降低冷应激大鼠机体内炎症反应的发生；促进冷应激大鼠血清中IL-2的分泌，增强冷应激大鼠细胞免疫水平；并可抑制ACTH与皮质酮在冷应激大鼠血清中的大量分泌，减轻大鼠的应激反应程度。