梨小食心虫中肠蛋白酶与寄主植物的适应性及其作为害虫防治靶标的研究

The oriental fruit moth, Grapholitha molesta, is an important agricultural pest worldwide. With the understanding that G. molesta moves between different crops and the foundation built from our research from a previous NSFC project on the midgut proteases and the midgut transcriptome of this insect, this proposal continues to focus the research on the midgut proteases of G. molesta. This project aims to understand the adaptive response of midgut proteases in G. molesta to host plants by examination of the change of midgut protease activities and larval growth on artificial diet and different host plants (tender shoots of peach, tender shoots of pear, peach, pear, plum, papaya, apple) to identify and acquire midgut protease genes and genomic information by analysis G. molesta midgut transcriptomes from larvae fed on different host plants; to identify functional protease genes as candidate targets for G. molesta control by quantitative analysis of protease gene expression and inhibition of gene expression with RNAi in G. molesta; and to identify protease inhibitors potent to the selected G. molesta midgut proteases by overexpression of the selected midgut proteases followed by analysis with protease inhibitors...The results from this project will provide us with knowledge important for development of insect pest control strategies by targeting midgut proteases, and with information useful for management of G. molesta on different host crop plants and with RNAi-based technologies and using midgut protease inhibitor-based biopesticide and transgenic plants.

梨小食心虫是重要的世界性果树害虫，昆虫中肠蛋白酶在适应寄主方面起重要作用。申请者从已完成的前一个基金中取得的成绩和经验及对梨小食心虫中肠蛋白酶和转录组初步研究的基础上，以梨小食心虫可转移危害不同寄主植物而成灾这一事实为出发点，拟以梨小食心虫中肠蛋白酶为研究对象，一方面运用生化技术测定梨小食心虫取食桃梢、梨梢、桃果、梨果、李果、木瓜、苹果七种寄主后中肠蛋白酶活性变化及生长发育状况，明确蛋白酶活性与寄主植物的适应性。另一方面运用转录组挖掘与不同寄主相关的中肠蛋白酶靶标基因信息，通过RNAi和荧光定量技术明确蛋白酶靶标基因功能，确定中肠蛋白酶防治靶标基因，进一步对其进行克隆和表达，筛选靶标蛋白酶抑制剂。研究结果将为以昆虫中肠蛋白酶为靶标的害虫防治、为有针对性地指导不同寄主上的梨小食心虫防治提供参考，为利用RNAi技术沉默防治害虫，研发含有抑制剂的生物农药和培育转基因抗虫作物提供理论依据。

梨小食心虫是重要的世界性果树害虫，昆虫中肠蛋白酶在适应寄主方面起重要作用。研究明确了梨小食心虫取食桃梢、桃果、梨果、李子、苹果及人工饲料不同寄主的生长发育和中肠蛋白酶活性，挖掘与不同寄主相关的中肠蛋白酶靶标基因信息，通过RNAi和荧光定量技术明确蛋白酶靶标基因功能，进一步对其进行克隆和表达，筛选出靶标蛋白酶抑制剂。取得的主要结果如下：.1. 取食苹果的梨小食心虫，发育历期短，繁殖力强和内禀增长效率高，蛋白酶活性最高；取食桃梢，发育历期长，幼虫存活率和内禀增长率低，蛋白酶活性最低。苹果为最适寄主，而桃梢为最不适宜寄主。.2. 基于RNA-seq技术获得了取食人工饲料的梨小食心虫幼虫中肠高表达的消化酶和解毒酶基因。.3. 基于RNA-seq技术挖掘取食不同寄主植物的梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶信息，通过GO功能、KEGG通路以及WGCNA模块分析，注释了18054个转录序列，比对出15269个基因，同时预测了2785个新基因。15个比较组合中，每组差异基因在286到4187之间，其中上调基因在148到1954之间，下调基因在83到1990之间。.4. 筛选到差异表达的胰蛋白酶靶标基因共17个，对9个的表达模式进行qRT-PCR成功验证。.5. 探索出获得稳定性良好的靶标基因dsRNA的技术和纳米粒子结合dsRNA提高RNAi干扰效果的新途径，成功验证了gm_03634靶标基因的功能，发现干扰后幼虫体重、雌性和雄性的蛹重均显著降低，生长发育受抑制。.6. 成功克隆和表达了gm_05190和gm_11541这两个梨小食心虫胰蛋白酶靶标基因，发现抑肽酶可以抑制其基因表达和蛋白酶活性，进而影响梨小食心虫生长发育，是具有应用前景的胰蛋白酶抑制剂。. 研究结果初步明确了梨小食心虫中肠蛋白酶适应不同寄主植物的机制，将为以昆虫中肠蛋白酶为靶标的害虫防治，研发含有抑制剂的生物农药和培育转基因抗虫作物提供理论依据。