细胞内单线态氧定量检测新方法及其与细胞氧化应激行为研究

The quantitative detection of intracellular reactive oxygen species (ROS) and the correlation study of ROS with disease to preventing long-term excessive oxidation and fixing the balance of intracellular antioxidant defense is of great significance.To obtain a ROS recognition element with high sensitivity and specificity and its quantitative detection method are critical problems to the further study of the biological oxidative damage and cellular antioxidant. According to the above problems, based on the recognition of rhodamine derivatives receptor for singlet oxygen, this project systematic study the structure-activity relationship and mechanism of the synthesis receptor to ROS recognition with sensing behavior. And then to establish a singlet oxygen recognition photochemistry sensing system.On this basis,this project will design a solid phase microextracting monolithic material using graphene oxide as the modifier through the covalent bonding method and in situ polymerization. Through the target analyte rhodamine derivatives of singlet oxygen modified compounds, we can design the surface modification structure of graphene oxide, build a solid phase microextracting monolithic device doped with organic-inorganic materials for separation and clarify the control mechanism of reversely designing a extraction material.The study is to establish an enrichment and quantitative detection method with high selectivity and efficiency for the trace target analytes in complex biological system and provide a quantifiable scientific basis for the research on specific oxidative damage.

开展细胞内活性氧的定量检测与细胞氧化损伤相关性研究对预防生物体长期过度氧化和生物抗氧化防御平衡修复具有十分重要的意义。获得灵敏度高、专一性强的活性氧识别元件和定量检测方法是生物特异性氧化损伤与抗氧化研究进一步发展所面临的一个关键问题。针对上述问题，本项目以罗丹明-衍生受体对单线态氧自由基识别作用的研究基础，系统考察合成受体的细胞内活性氧识别传感行为的构效关系和作用机制，研究建立以单线态氧为检测目标的光化学识别传感体系；在此基础上，以氧化石墨烯纳米材料为修饰载体，利用表面共价键合和原位聚合等化学和物理方法，以罗丹明衍生物的单线态氧修饰化合物为萃取目标，反向设计氧化石墨烯表面修饰结构，设计构建功能化氧化石墨烯掺杂的整体固相微萃取小柱，阐明萃取材料反向设计的控制机制。建立针对活性细胞内微量或痕量目标分析物高选择性富集和定量检测方法，为特异性氧化损伤研究提供可量化的科学判别依据。

本基金项目以罗丹明-衍生受体对单线态氧自由基识别作用，以合成受体的生物体系活性氧识别传感行为的作用机制，以氧化石墨烯纳米材料为修饰载体，利用表面共价键合与原位聚合等化学和物理方法，以罗丹明衍生物的单线态氧修饰化合物为萃取目标，设计构建功能化氧化石墨烯掺杂的整体固相微萃取小柱，以建立针对复杂生物体系中微量或痕量目标分析物高选择性富集、分离和高效定量检测方法为研究背景，为特异性氧化损伤研究提供可量化的科学判别依据。.本基金主要构建了萘基、呋喃基、咪唑基罗丹明荧光探针，开展了荧光探针与单线态氧的识别检测研究，阐明罗丹明基荧光探针的呋喃、蒽或咪唑基团与单线态氧反应生成酮、内过氧化合物使分子荧光得到增强的识别机制。通过蒽基荧光探针与刺激肝癌细胞产生的内源性单线态氧的反应使探针荧光强度增加研究，阐明了组氨酸作为活性氧清除剂通过阻止细胞内单线态氧与活性基团蒽发生内过氧化反应与细胞荧光不发生变化的内在联系。.通过制备氮掺杂纳米多孔碳尺寸匹配选择性萃取材料，对细胞内特征荧光标志物的定量检测成功应用于HepG2和Hela细胞中的活性氧的定量测定，建立了细胞内活性氧的PPN-SPE-HPLC-FLD联用的间接定量评价与检测方法。.开展了阿奇霉素、X射线等外界条件刺激HpG2细胞产生活性氧，通过定量检测细胞内荧光标志物研究条件刺激对细胞内活性氧浓度变化影响，及对细胞生理活性的变化影响。.设计合成新型分子荧光探针用于检测线粒体内源性硫化氢、次氯酸含量变化，开展了系统生物成像实验与分子荧光检测的构效关系与识别机理研究。.制备了磁性N掺杂三维骨架类石墨烯碳材料，这种碳材料通过结构尺寸匹配、静电作用与乙酰胆碱酶高表达的外泌体发生选择作用，结合乙酰胆碱酶荧光检测探针对疾病引发酶浓度改变实施监测。本项目通过四年的实施已经完成基金申请规划、设计的研究目标，也为下一步研究工作的开展提供了有力的支撑。