小型猪CYP药物代谢动物模型关键问题基础研究

CYP系统差异是实验动物及其与人药物代谢特性种属差异的主要原因。课题组在证实猪与人CYP3A代谢最为相似、克隆表达了包括人CYP2D6在内的29种CYP基因并应用于代谢评价、具备转基因猪制备技术平台并获得转基因猪的基础上，针对小型猪CYP药代动物模型关键问题： FDA药物代谢体外试验规程中10种主要人类CYP基因的猪同源功能基因有待确定；相应猪同源CYP酶的代谢特性及其与人的相似性和差异不清楚；需制备与人差异更小的小型猪药代模型。拟通过RNA深度测序进行小型猪肝转录组学分析，确定其肝脏CYP功能基因的种类、序列及转录表达情况；构建其对应FDA人类10种主要CYP基因的小型猪单一酶体外表达及酶反应体系，确定其代谢特性；制备人源化CYP2D6转基因小型猪。为小型猪作为药物代谢动物模型提供选择依据，建立新型小型猪药代动物模型。

CYP系统差异是实验动物及其与人药物代谢特性种属差异的主要原因。CYP3A和CYP2D是人最重要的CYP药物代谢酶，分别代谢50%和15%以上的药物。实验动物中猪的CYP3A与人最为相似，而CYP2D代谢特性与人有一定差异。本项目完成了巴马香猪肝脏转录组学RNA-seq分析，初步完成巴马香猪P450基因注释，包括P450基因核酸和蛋白序列信息、blast结果和pfam结果。为进一步阐明小型猪CYP3A亚家族各成员的详细代谢特性，应用Real-time RT-PCR方法，进行了小型猪CYP3A亚家族的3个基因CYP3A22、CYP3A29、CYP3A46在小型猪16个组织中的组成型转录表达研究，结果表明：3个CYP3A基因均在肝脏中表达量最高；肝脏中CYP3A22表达量最高，其它肝外组织CYP3A46表达量最高，CYP3A29除在在十二指肠的表达量高于CYP3A22外，在其它所有组织中表达量最低。同时，利用Bac-to-Bac 系统体外重组表达小型猪CYP3A22、CYP3A29、CYP3A46，检测它们对CYP3A特征底物睾酮、咪达唑仑和硝苯地科的代谢特性并比较其与人CYP3A4和CYP3A5的相似性，结果表明：小型猪CYP3A与人的药物代谢动力学和代谢产物相似，在消除速度和底物偏好上存在不同，小型猪和人的CYP3A代谢特征与底物特异性有关。为克服小型猪与人CYP2D6代谢的差异，利用在肝脏特异性高水平表达的载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因启动子，制备了肝脏特异性表达的人源化CYP2D6转基因小型猪。CYP2D6转基因猪检测到人hCYP2D6 mRNA的高表达，转基因猪肝微粒体的右美沙芬代谢活性显著高于野生型猪，加入人CYP2D6抑制剂奎尼丁后对转基因猪的右美沙芬代谢活性产生抑制。本研究将为药物临床前研究将小型猪作为药物代谢实验动物提供基础数据及选择依据，获得的与人更为相似的人源化小型猪将为药物代谢研究提供新动物模型。