苦参碱联合甘草甜素诱导肝癌细胞分化与DNA甲基化关系研究

前期研究发现苦参碱体外可以诱导肝癌细胞分化，但作用机制不明；甘草甜素可以增强苦参碱延缓DEN诱发大鼠肝癌的形成，体外可以诱导肝癌细胞分化，但苦参碱联合甘草甜素诱导肝癌细胞分化及体内抗肝癌作用机制国内外未见报道。研究表明苦参碱诱导K562 细胞分化与调控基因组DNA甲基化模式有关。DNA甲基化模式的变化是否参与苦参碱及其联合甘草甜素诱导肝癌细胞分化和体内抗肝癌作用也未见报道；本研究以细胞形态变化、4种肝癌分化指标评价苦参碱联合甘草甜素诱导肝癌细胞分化作用；以c-myc、c-fos癌基因甲基化、DNMTs 活性和p16等肝癌相关基因甲基化模式的变化揭示苦参碱及联合甘草甜素诱导肝癌细胞分化和体内防治肝癌的作用机制，为苦参碱联合甘草甜素的临床应用及开发提供实验依据，从新的角度研究中医药在肿瘤防治中的作用并揭示其机理，探索中医药防治肝癌新的研究模式和新思路，为诱导肝癌细胞分化机制的研究提供借鉴。

本课题在预定时间内顺利完成，发表了1篇英文论著，待发表论著2篇，培养研究生1名，参加学术会议3次，并在国际肝胆胰协会中国分会第六届全国学术研讨会并作会议报告1次。.本研究以天然产物苦参碱联合甘草甜素来诱导肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2细胞株，发现苦参碱联合甘草甜素可以有效阻滞细胞周期，抑制肝癌细胞增殖，联合作用的效果要好于苦参碱或者甘草甜素单独处理；能有效降低AFP、r-GT活性，诱导肝癌细胞分化。在此基础上，利用甲基化特异性PCR(Methylat ion-specifiC PCR，MSP)方法检测甘草甜素联合苦参碱对肝癌细胞p16基因和MGMT基因甲基化状态的影响，探讨甘草甜素联合苦参碱诱导肝癌细胞分化的可能机制。结果发现甘草甜素联合苦参碱对SMMC-7721细胞、HepG2细胞p16基因和MGMT基因具有一定的去甲基化作用；可让表达缺失的p16基因和MGMT基因重新表达；可能通过调节DNMTs表达水平调整DNA甲基化状态，从而起到防治肝癌作用。体内实验通过构建SMMC-7721和HepG2肝癌裸小鼠肿瘤模型，研究苦参碱联合甘草甜素体内抗肿瘤作用，及二者联合治疗对增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果发现苦参碱联合甘草甜素可以有效抑制SMMC-7721和HepG2肝癌裸小鼠中肿瘤的生长，SMMC-7721肝癌裸小鼠中瘤质量抑瘤率在71.8%，HepG2肝癌裸小鼠肿瘤质量抑瘤率在66.1%，瘤中增值相关的PCNA基因表达水平在治疗组中也显著下降，凋亡抑制基因BCL2基因表达水平下降而凋亡基因BAX的表达增加。苦参碱联合甘草甜素可以有效抑制裸鼠体内成瘤，是新颖的高效低毒的抗肿瘤候选药物。