基于单分子DNA定量技术的肿瘤原代培养物在临床前化疗药物筛选中的应用

In vitro chemotherapeutic drug-test for each tumor, in analogue to antibiotic-tests for microbial pathogens, would be highly desirable in personalized tumor therapy. Our previous study proved the concept of measuring the proportions of tumor cells and non-tumor cells in a mixed culture enables the use of primary cultures and the assessment of chemotherapeutic drug sensitivity and selectivity. In this project, three-dimensional (3D) cultivation will be used to culture primary cells from plexiform neurofibromas (PNFs) and malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Primary cultures will be treated by imatinib, nilotinib and temozolomide with different concentrations. Effective chemotherapy drug will be screened by monitoring proportional changes of tumor cells and non-tumor cells using droplet digital PCR (ddPCR). The new method called d-SPECT (ddPCR in vitro Specificity Test), which will be established in this project, has an important significance in individualized tumor therapy. In addition, d-SPECT can be used to find new drugs and has potentials in personalized therapies for other tumors.

针对单个肿瘤的体外化疗药物测试，类似于感染性病原微生物药敏试验，在肿瘤个体化治疗中具有重要价值。本课题组前期研究表明，利用特异性免疫荧光染色评价同一肿瘤来源的原代肿瘤细胞和非肿瘤细胞在药物处理前后比例变化，可以评估化疗药物的敏感性和选择性。本课题拟通过水分子凝胶三维（3D）培养技术培养丛状神经纤维瘤（PNF）和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）原代细胞（包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞），通过单分子DNA定量技术--微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）精确定量不同浓度伊马替尼，尼罗替尼和替莫唑胺处理后肿瘤基因和参考基因拷贝数，分析肿瘤细胞和非肿瘤细胞比例变化，以筛选最有效的化疗药物及其治疗指数。本项目拟建立基于ddPCR技术的肿瘤原代培养物评价化疗药物敏感性的新方法（d-SPECT），在临床肿瘤个体化治疗中具有重要的意义。此外，该方法还可用于新药的发现，以及具有潜在的向其他肿瘤的个体化治疗推广的价值。

个体化治疗是肿瘤治疗研究的一个重要方向。在临床肿瘤化疗及新药发现过程中，药物期望的治疗效果通常伴随不同程度的毒性作用。本研究探索利用微滴数字PCR技术（ddPCR）建立一种基于肿瘤混合培养物体外评价化疗药物效能的新方法，主要成果包括：建立了基于GoMatrix 3D 细胞培养体系的丛状神经纤维瘤（PNF）和恶性周围神经鞘瘤（MPNST）原代细胞三维培养模型，培养的Schwann细胞活力较普通培养强，形态更典型，可用于各种体外试验研究；检测NF1基因的7个微卫星标志， PNF和MPNST培养的Schwann细胞（肿瘤细胞）存在杂合性缺失（LOH），即只有单拷贝NF1基因，而成纤维细胞（非肿瘤细胞）具有双拷贝NF1基因，两类细胞均具有双拷贝的RPP30基因（参照基因）；利用ddPCR检测肿瘤原代3D培养细胞中NF1基因和RPP30基因拷贝数，可计算出肿瘤细胞和非肿瘤细胞的数量及比例；通过ddPCR检测不同浓度的尼洛替尼（Nilotinib）和伊马替尼（Imatinib）处理前后肿瘤原代细胞中的NF1基因和RPP30基因拷贝数，可推算肿瘤细胞和非肿瘤细胞数量及其变化，计算药物半数抑制浓度（IC50）；研究结果证明肿瘤细胞的数量与药物的浓度成反比，尼洛替尼的IC50低于伊马替尼，表明前者对肿瘤细胞抑制效果优于后者。利用ddPCR技术和肿瘤原代培养物可用于体外测试化疗药物的效能和毒性作用，该方法可同时测试多种药物，在临床化疗药物筛选和肿瘤个体化治疗中具有潜在的应用价值。