西双版纳红色原鸡IFN-γ基因多态性分布及其对禽流感和新城疫免疫效果的影响

鉴于免疫应答水平可作为抗病力的间接选择指标，本项目选取具有广谱抗病毒及免疫调节活性的病毒诱导性细胞因子干扰素（IFN）-γ的编码基因为研究对象，以抗病力强、群体遗传多样性丰富的西双版纳红色原鸡为实验材料，接种国家强制免疫病种H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）与新城疫（ND）二联灭活疫苗，采用血清学技术检测原鸡血清中的血凝抑制抗体效价和IFN-γ及相关细胞因子IL-2的蛋白表达水平；采用基于聚合酶链式反应的基因克隆、扩增、测序和分型等分子生物学技术，测定原鸡IFN-γ基因多态性的位点、数量、类型及频率，检测外周血单个核细胞IFN-γ及IL-2的mRNA表达水平；经统计学分析，初步筛选出与机体抗病毒免疫应答水平呈正相关的原鸡IFN-γ基因功能性多态性位点及其构成的单倍型，为保护与利用云南特有野生鸡种质资源、培育抵抗多种病毒性传染病的鸡品种、协助对重要疫病的风险预测及中长期防控提供科学依据。

项目组在自主设计出能高度特异扩增红色原鸡IFN-γ cDNA的克隆用引物及荧光PCR引物，并对PBMC体外培养物的ConA或特异性病毒抗原刺激浓度及诱导表达时间进行优化的基础上，对收集自滇南的62只健康红色原鸡接种NDV与HPAIV（Re-5株）灭活苗，采用HI试验测定免疫前及再次免疫后的血清HI抗体效价，采用荧光定量PCR（qPCR）技术测定ConA诱导PBMC培养物的IFN-γ mRNA表达水平，采用ELISA测定特异性病毒抗原回忆性诱导PBMC培养物的IFN-γ蛋白表达水平；采用PCR+1技术分别扩增及克隆IFN-γ启动子区域（n=62）和编码区（n=34），经对重组质粒DNA双向测序，结合应用DNAStar软件进行序列比对及与现有家鸡资料比较，确定IFN-γ SNP位点、数量及类型；最后采用SAS软件GLM过程对频率观测值高于5的SNP基因型与相应HI抗体效价进行最小二乘均值关联分析。结果发现，实验原鸡群体免疫前血清HPAIV抗体效价均为零，但有23只原鸡NDV抗体呈阳性，再次免疫后二者效价均有不同程度升高；ELISA测定未经抗原刺激的PBMC对照组误差较大，故相关结果暂不予采纳；qPCR检测发现34只原鸡PBMC在相同诱导条件下IFN-γ mRNA表达水平存在较大差异；在原鸡IFN-γ编码区和启动子区域分别检测到19和140个SNP位点（含+2133 A→T引起Glu→Val），其中-316A/G SNP频率最高；针对HPAIV，-316AA基因型的HI抗体效价（n=32，8.00±0.252 log2）显著高于GG基因型（n=7，6.57±0.539 log2）（P=0.0196<0.05），AG基因型的抗体效价（n=23，7.74±0.298 log2）也高于GG基因型，但差异不显著（P=0.0629）。研究结果表明，红色原鸡IFN-γ SNP明显较家鸡丰富，且启动子SNP明显较编码区丰富；首次在原鸡属IFN-γ编码区发现存在一个导致错义突变的SNP；-316A/G SNP基因型与HPAIV抗体应答水平存在关联性，即携带-316A等位基因的原鸡个体可能较GG基因型纯合子对HPAIV的抗病力强，这对发掘利用该野生鸡种质资源、增强疫苗效力和协助抗病育种可能有一定参考意义。通过开展本基金项目工作，已支持2名硕士研究生完成毕业论文并在中文核心期刊发表文章3篇。