干细胞对自噬过程的影响及在促高血糖难愈创面修复中的作用

The injury of local excessive inflammatory reaction is one of the important reason of chronic skin ulcer, stem cells have the ability for accelerates wound healing. Our previous studies showed that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can accelerate the healing process of skin wound in hyperglycemia mice, and during the process of wound healing, BMSCs could alleviate hyperglycemia mice wound tissue excessive inflammatory reaction effectively, however, the mechanism is still unclear. It has been reported that the autophagy pathway and related proteins may play important roles in regulating immune response and controlling excessive inflammation. Thus, we speculate that BMSCs alleviate hyperglycemia mice wound tissue excessive inflammation probably by regulates autophagy pathway. In this study, we will choose macrophage as research object, using cell biology and molecular biology techniques including immunofluorescence, qPCR、Western Bolt、Elisa, we will comprehensively study the function and involved key mechanism of BMSCs in regulating inflammation through autophagy pathway. Our study will provide theoretical basis and practical value for seeking new method in the treatment of chronic skin ulcer.

过度炎症反应是导致高血糖机体创面难愈合的重要原因之一，而干细胞具有促愈作用。我们前期工作也发现小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）能够促愈高血糖小鼠创面，同时可以有效缓解难愈创面过度炎症反应，但相关的机制并不清楚。报道显示，自噬通路及其相关蛋白在参与调控免疫应答和控制过度炎症反应中发挥重要作用。因此我们推测，BMSCs很可能通过调控自噬过程来调节免疫细胞的免疫进程。本研究中，我们将利用小鼠巨噬细胞为研究对象，利用免疫荧光技术、qPCR、Western Bolt、Elisa等细胞生物学和分子生物学技术，体外和体内综合分析BMSCs对自噬过程的影响以及对高血糖难愈创面炎症反应的影响。该研究为开发新型促愈慢性创伤的方法提供科学指导和依据。

过度炎症反应是导致高血糖机体创面难愈合的重要原因之一，而自噬在慢性创面愈合过程中发挥一定的作用。在本研究中，我们在体外和体内调控自噬过程观察巨噬细胞极化变化，探讨自噬与巨噬细胞之间极化的关系。我们首先用Rapa和Baf A1分别作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞，处理后发现：Baf A1处理后RAW264.7细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α显著增高（P<0.01），而抑炎性细胞因子IL-10、IL-13的含量变化无显著差异（P>0.05）。Baf A1处理的细胞表面标志物中CD197和HLA-DR（M1标志物）双阳性率与对照组相比显著升高（P<0.05），免疫荧光结果显示，Baf A1处理后细胞自噬小体显著增多（P<0.05），同时Western blot结果显示LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高（P<0.05），而P62蛋白表达无显著差异（P>0.05），该结果与LPS处理组类似。在自噬激活剂Rapa处理组中，自噬体同样显著增多（P<0.05），但P62蛋白表达显著降低（P<0.05）。这些结果说明：巴弗洛霉素可以诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 向M1方向极化。然后，我们在体内观察自噬抑制剂Baf A1对高糖难愈创面愈合的影响。我们发现Baf A1处理可以加速db/db小鼠创面愈合，并且表现出良好的愈合效果，并且该过程并不影响动物的基础代谢。取材于14天时的皮肤组织，通过免疫组化检测PCNA表达，显示BafA1处理组优于db/db组。在db/m组和Baf A1两个处理组中，促炎性细胞因子TNF-α在第6天时显著升高，抑炎性细胞因子IL-10在第9天时显著增高，然而两种细胞因子在db/db组中均为发现有明显变化。因此，Baf A1可以促进高糖难愈创面愈合，可能与其促进细胞增殖、调控炎症平衡有关。所有的结果显示BafA1可能用于治疗难愈性创面，但仍需进一步研究其潜在机制。