核心生物钟基因Bmal1在脊椎动物早期发育中的功能研究

Circadian clock is mainly generated through transcriptional/translational feedback loops of core clock genes (Bmall, Clock, Per1/Per2/Per3, Cry1/Cry2, Rev-erbα/β). Circadian behavior and circadian oscillation of gene expression are not detected during early embryonic development and embryonic stem cell. Day-night rhythms in the fetal rat SCN were first detected between E19 and E21. However the function of Bmal1 in early development and how the circadian clock is regulated during early development is not clear. Bmal1 is a maternally deposited gene and highly expressed at embryonic stage. We suspected that Bmal1 may play a role both in circadian clock development and embryonic development. Here we plan to study the function of Bmal1 in early development using system biology approach. First, to identify the conserved Bmal1 targets in vertebrate early development on the whole transcriptome level, RNA-seq will be applied to Bmal1 deficient zebrafish and mice embryos. Second, we will integrate the conserved Bmal1 targets with the published embryonic developmental transcriptome data in vertebrate to identify the targets that are involved in early development. Then promoter reporter assay will be applied to validate the direct binding of Bmal1 and functional study of the selected targets will also be conducted. Finally, by integrating the published mouse tissue/cell line Bmal1 knockout RNA-seq data and Bmal1 ChIP-seq data, we plan to investigate the targets and the functional difference of Bmal1 in different developmental stage. Our study will pave the way for the study of early development of circadian clock.

昼夜节律的分子基础是由Bmal1等核心节律基因构成的反馈回路。Bmal1是母系遗传基因，在胚胎发育早期和胚胎干细胞中Bmal1表达量很高但并不呈现节律振荡，在胚胎发育的后期Bmal1才产生节律振荡，进而产生完整功能的负反馈回路。目前关于Bmal1在胚胎发育中的功能以及生物钟早期发育调控机制的研究很有限。本项目拟采用系统生物学和实验生物学相结合的方法系统研究Bmal1在早期发育中的功能。通过在不同发育时期Bmal1缺失的斑马鱼和小鼠的RNA-seq，整合已发表的脊椎动物胚胎发育转录组数据，找到保守的Bmal1靶基因。然后和已发表的Bmal1缺失的成年组织及细胞系转录组、ChIP-seq数据比较，研究在不同的发育时期Bmal1靶基因及功能的变化。同时利用斑马鱼的节律基因荧光报告鱼系，在活体单细胞水平研究Bmal1在早期生物钟发育中的功能。该项目的成功实施将为生物钟早期发育研究提供新的思路。

脊椎动物的昼夜节律主要是由核心钟基因Bmal1等构成的转录/翻译反馈回路产生的，目前的研究表明这个分子钟是在发育过程中逐渐建立的。但是目前尚不清楚单个细胞的钟是如何在发育过程中建立的，以及受到哪些因素的影响。为了研究这个问题，我们构建了可以活体实时观测斑马鱼单细胞节律的报告基因系统，其携带由核心生物钟基因的启动子驱动的不稳定的荧光蛋白，以报告单细胞水平的昼夜节律。通过对该鱼系的长时程成像和3D重建，我们观察到节律报告基因表达起始于松果体中的感光细胞，然后扩散到其他脑区的细胞中。在松果体中，我们发现了报告基因表达的异质性，松果体中每个细胞中的报告基因的表达都呈现为昼夜节律振荡叠加于细胞类型特异的发育轨迹上。我们还发现报告基因在单细胞中的表达在光暗周期下显示出同步的昼夜节律振荡。但是在持续黑暗中饲养的斑马鱼中，单细胞的节律振荡被显著的抑制，而他们的发育趋势仍然持续。这表明光照对斑马鱼发育早期昼夜节律产生具有重要作用。利用该鱼系，我们还研究了斑马鱼bmal1b敲除对生物钟早期发育的影响，我们发现bmal1b敲除的斑马鱼幼鱼的震荡和野生型斑马鱼并没有明显差别。我们的研究结果显示斑马鱼钟松果体的钟是最先建立的,这预示着松果体在斑马鱼生物钟的建立过程中有重要的作用。为了研究松果体如何影响周边组织中生物钟的建立， 我们接着在单细胞水平研究斑马鱼松果体投射神经元的形态与功能，目前我们已经追踪了50个斑马鱼投射神经元并进行了松果体投射神经元的损毁实验，我们发现松果体投射神经元毁损后会显著影响斑马鱼幼鱼在晚上的活动性。