当归补血汤补血功能的作用靶标及其信号调控机制的体内外研究

The deficiency in the functional mechanism is a serious impediment to the modernization of traditional Chinese medicine (TCM). Therefore, by using modern science and technology, the mechanistic determination can exhibit the science of TCM, and help to build the theoretical basis of TCM in application and promotion. Danggui Buxue Tang (DBT) is a classic formula for enriching Blood and nourishing Qi. These two major functions had been proven in clinic for hundreds years. However, their molecular mechanisms were still not clear. In recently years, our team had approached some theoretical ideals in the enriching Blood function via regulating erythropoiesis: erythropoietin (EPO), a critical factor for erythropoiesis, can be induced by DBT through regulating Hypoxia Inducible Factor (HIF) signaling pathway. The preliminary results had demonstrated the multi-target and multi-channel characteristics of DBT in regulating the expression of EPO, however, the regulation mechanisms still need to further explore and improve. Meanwhile, key problem is whether the mechanism of in vitro cell model can be verified in animal models. Therefore, this study plans from cells to animals, from in vitro to in vivo, to study the biological effects of DBT and its signaling pathways of blood function, and aims to perfect the blood mechanism of DBT. Completion of this study can not only compensate for the defects of blood mechanism in DBT, but also provide exploratory experience and guidance for the mechanistic study and modernization of other TCM formulae.

中药作用机理的匮乏严重阻碍了中药的现代化发展，因此利用现代科学技术揭示中药的物质基础和作用机理有助于展现中医的科学性，也有助于增强中药应用与推广的理论依据。当归补血汤是中医"补血益气"的经典方剂，其补血功效在几百年实践中已经得到了充分证实，但作用机理却不明确。负责人研究发现当归补血汤的补血功效与红细胞生成素（EPO）密切相关，其活性成分通过调控HIF信号通道促进EPO的基因表达，最终实现补血功效；对HIF信号的调控显示出此方具有多靶点多通路的特性，但其中的调控机理还需要进一步探索和完善。同时，此方剂的体外作用机理是否能在动物体内中得到有效验证也是亟待解决的问题。因此，本研究将从细胞到动物，从体外到体内研究当归补血汤活性成分的作用靶标及其信号调控机制，阐明其完善的补血作用机理。本研究不仅能弥补当归补血汤补血机理阐述中的缺陷，也为其他传统复方的机理研究和现代化提供探索性经验和指导。

当归补血汤源自李东垣的《内外伤辨惑论》，由黄芪和当归（5:1）组成，组方精炼，其补血功效在历史实践中已得到了充分证实，但其物质基础和作用机理却不明确。本项目研究了：第一，将携带缺氧反应元件(hypoxia-response element, HRE)的质粒转染到了HEK293T人肾细胞上，然后利用转基因HEK293T细胞揭示了当归补血汤对HRE的调控作用。表明当归补血汤能增加HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1)基因的转录和蛋白的表达，HIF-1正是EPO的上游的重要调控蛋白。这些结果证实了当归补血汤能通过控制HIF信号通路来达到调节EPO生成的目的，初步揭示当归补血汤体外补血的分子机理，也验证了此古方在补血方面的双重功效。第二，研究了当归中两个主要成分（阿魏酸和当归油）在当归补血汤中的作用。结果发现阿魏酸具有正面作用，它能促进黄芪中活性成分的溶出，提高黄芪水提物的活性；而当归油则相反，它会抑制黄芪中活性成分的溶出，降低其活性。因此，本研究也证实了复方中当归补需要酒洗的原因，因为酒洗能使当归中的当归油降低，从而提高了它在复方中的有效性。第三，利用GC-QQQ-MS/MS鉴别出了当归油中的四种主要成分。同时，发现当归油会抑制黄芪中成分的溶出，包括黄芪甲苷Ⅳ、毛蕊异黄酮、芒柄花素、总多糖、总皂苷、总黄酮等；而且还能影响当归补血汤抗血小板凝聚、NO生成、造血功能等生物活性。说明当归油在当归补血汤中属于负调节的成分，也揭示了当归需要“酒洗”的原因。第四，利用切除卵巢的老鼠评估了当归补血汤的类雌激素活性，发现当归补血汤能刺激雌激素受体/和芳香烃受体的基因表达，但是响应模式与17-estradiol截然不同；这些结果说明当归补血汤具备一定的体内雌激素特性，可以用于女性雌激素的替代疗法。.虽然多靶点多通路的特性决定了中药的机理研究远比西药复杂，但本课题组在自然科学基金的支持下，对当归补血汤功效及作用机理的研究已取得了一定进展。现有研究成果证明了借助于现代科学技术和方法，中药药效的内在作用机理是可以被逐渐阐明和完全揭示的。因此，利用现代科学技术研究简单方剂---当归补血汤补血功效的作用机制，以此建立中药复方作用机理的研究模式，不仅能弥补当归补血汤功效机理阐述中的缺陷，也能为其他传统复方的机理研究和现代化发展提供探索性经验和指导。