水稻纤维素合成或调控相关基因BC-t的克隆与功能鉴定

Cellulose is a major component of cell walls and plays a critical role in erect growth and lodging resistance in plants and thus to investigate molecular mechanisms of its biosynthesis is of great significance in improving crop yield. It has been shown that multiple genes participate in the regulation of cellulose biosynthesis and cell wall remodeling and some of functional genes have been cloned and identified. Isolation and characterization of mutants associated with cell wall components is one of the most powerful approaches to analyze their biological functions. In this proposal, we already obtained a brittle culm-t (bc-t) mutant from a rice mutant pool induced by ethylene methylsulfonate (EMS). Genetic and biochemical analyses indicated that bc-t is a new mutant related with cellulose biosynthesis or its regulation and controlled by a single recessive gene. The mutation gene was finely mapped to a 48-kb interval on the long arm of Chromosome 9 using a map-based cloning strategy. Base on these findings, a more fine physical map and sequencing of this interval will be simultaneously carried out to clone this target gene. After that, a complementation test, over-expression, cellular localization of the target gene or its product will be performed by molecular and cellular biotechnologies to understand biological roles of this target gene in cellulose biosynthesis or its regulation.

纤维素是构成植物细胞壁结构的主要成分，对植物直立生长、抗倒伏具有重要的生物学意义。因此，深入开展植物纤维素生物合成机制对提高粮食产量具有重要的理论与现实意义。已有的研究表明，有多个基因参与调控纤维素生物合成与细胞壁重塑，部分功能基因已被克隆鉴定。鉴定并分离细胞壁组份相关突变体是分析各组份生物学功能最有效的途径之一。本申请项目在EMS化学诱变创建的水稻突变体库中筛选到一株与水稻脆杆突变体bc-t (brittle culm-temporary)。遗传和生化分析表明bc-t为新发现的纤维素合成或调控相关突变体，受一隐性基因控制。已利用图位克隆的方法已将其精细定位于水稻第9染色体长臂上48 kb的物理区间内。在此基础上，本申请项目拟进一步开展更精细的物理图谱构建，同时开展目标区间的序列测定，分离并克隆该突变基因；利用分子和细胞生物学技术进行突变基因互补试验、过表达分析、亚细胞定位及其生理生化分。

细胞壁参与细胞的生殖、生长、分化、识别和防御等一系列过程。纤维素作为细胞壁的主要成分，其含量和沉积直接影响着细胞壁的功能，许多脆性突变体都与纤维素的异常有关。水稻是研究纤维素合成、调控及细胞壁沉淀机理的理想材料。本项目利用图位克隆、分子克隆、转基因等现代遗传和分子生物学技术从水稻武运粳7的EMS突变体bc88中分离和克隆到OsBC88基因，该基因编码一个纤维素合酶催化亚基OsCesA9。通过农杆菌介导法将OsBC88融合表达载体导入水稻日本晴和烟草中，并作了OsBC88的表达分析。.我们发现bc88突变体性状由单隐性核基因所控制，利用Osbc88的F2遗传分离群体和经典的图位克隆技术，分离并克隆到OsBC88突变基因，并发现其突变由单碱基替换(CCG→CTG)引起，进而引起氨基酸序列的改变（Pro→Leu）。OsBC88在根、茎、叶、鞘、花中均有表达，其中在茎和根中表达量较高，这可能为Osbc88的半矮表型提供了证据，即OsBC88突变后影响了根部的正常发育及功能，进而影响地上部分的生长。将OsBC88与GFP的融合表达载体转入水稻和烟草表皮细胞中，发现OsBC88/OsCesA9定位于质膜上。质膜是纤维素合成的主要场所，这充分说明了OsCesA9是水稻次生细胞壁中纤维素合成必不可少的纤维素合酶催化亚基之一。本研究结果为进一步研究OsBC88在纤维素合成和细胞壁形成中的分子作用机理提供遗传学和细胞学证据，为培育抗倒伏或脆嫩性状的理想育种材料提供了理论基础和依据。