具有靶向性且可双重响应细胞内环境非病毒基因载体的研究

本项目将研制一种聚合物－磷酸钙(CaP)纳米粒子作为新型siRNA载体。通过电荷复合，PEG-SS-PAsp(DET-Aco)与siRNA所带负电荷与CaP晶体表面的正电荷发生静电作用，抑制了CaP晶体生长，原位制备CaP纳米粒子。PEG外层的屏蔽作用赋予纳米粒子在体内环境中具有较高的稳定性。当纳米粒子进入细胞之后，双硫键断裂，PEG保护层逐渐从纳米粒子表面脱离。同时，由于Aco基团在核内体酸性环境中发生降解，导致DET作为侧链末端基团被"暴露"出来。带正电荷的DET具有类似PEI的核内体逃逸功能，因此纳米粒子可以有效地从核内体逃逸。这样，同样带正电荷的高分子链和CaP晶体发生电荷相斥以及PEG从纳米粒子脱落，导致纳米粒子分解，实现siRNA的细胞内智能释放。为了实现纳米载体的肿瘤靶向输送，在PEG链端安装靶向基团，使纳米粒子可以和某些肿瘤细胞进行特异结合，进一步提高基因敲除效率。

最近几年，用小RNA (short interfering RNA, siRNA)实现RNA干扰（RNAi) 为治疗传染性疾病或恶性肿瘤提供了崭新的机会。RNA干扰以及其他基因治疗技术中最重要的一个环节就是选择适当的基因载体。由于非病毒载体具有低毒、低免疫反应以及使用简单、制备方便等优点，因此，相关的研究越来越受到重视。..磷酸钙（CaP）是人体硬组织的主要无机盐成分。由于磷酸钙具有无毒性和良好生物相容性等优点，它已经被广泛地应用于生物医学领域。由于磷酸钙晶体表面带有的正电荷，它可以和带有负电荷的核酸发生电荷作用而形成复合颗粒。利用CaP制备的基因载送体系具有成本低、制备简便等优点。因此，研究人员对CaP用于基因载送体系表现出了浓厚兴趣。..本项目研制了一种生物相容且制备简易的有机－无机杂化纳米材料作为智能靶向恶性肿瘤的siRNA载体。其中的有机组分是PEG-SS-PAA(DET-Aco)共聚物和siRNA，无机组分是磷酸钙。由于PEG-SS-PAA(DET-Aco)可以在生理pH的条件下抑制磷酸钙晶体的生长，纳米尺度的磷酸钙纳米复合颗粒在溶液中原位生成。由于PEG外层的屏蔽作用，纳米粒子在体内环境中具有较高的稳定性。PEG与PAA(DET-Aco)之间通过双硫键连接，具有显著的优点。当纳米粒子被癌症细胞摄入之后，由于细胞内还原性谷胱甘肽的浓度比细胞外高两至三个数量级，因此双硫键断裂，PEG从纳米颗粒外壳脱离，获得PAA(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米颗粒。另一方面，在核内体/溶酶体酸性环境中，DET-Aco侧链的Aco末端发生降解，因此保护的DET末端“暴露”。在酸性环境中，DET末端带有正电荷，并产生“质子海绵”效应，可以显著提高纳米颗粒的核内体逃逸能力出来且可以导致纳米复合粒子分解，从而实现了siRNA的细胞内智能释放。..为了实现纳米载体的肿瘤靶向输送，我们在PEG链端安装整合素RGD靶向基团，使纳米粒子可以和HeLa肿瘤细胞进行特异性结合，从而提高基因沉默效率。体内实验表明，RGD基团修饰的纳米复合颗粒主要聚集在荷瘤小鼠的肿瘤部位,在其他器官没观察到明显聚集。另外，纳米复合颗粒对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效率进行了评价。数据显示，采用PEG-SS-PAA(DET-Aco)/siRNA/CaP纳米复合颗粒，可以有效抑制肿瘤的增长。