选择性抑制LDH-C活性的小分子化合物筛选及抗癌作用研究

LDH-C, a cancer-testis antigen (CTA), is expressed in a variety of cancers. It may play a fundamental role in aerobic glycolysis (Warburg effect) of cancer cells just like LDH-A. Through systematically screen and RNA interference, the project team found that small molecules inhibiting LDH-A also inhibit the activity of LDH-C and that to silence the expression of LDH-C could effectively inhibit the proliferation of cancer cells. Therefore, LDH-C is a potential target for developing anti-cancer medicine. However, to date no studies have been carried out to systematically screen the small molecules that can inhibit LDH-C, so we plan 1) to perform virtual screening against small molecule database to find molecules that can inhibit LDH-C theoretically; 2) to prepare human LDH-A4 and LDH-C4 by E. coli engineering, and to screen the theoretical inhibitors by enzyme kinetic assay using purified LDH-A4 and LDH-C4 to get the selective inhibitors of LDH-C4 over LDH-A4; 3) to evaluate the selective inhibitor candidates of LDH-C4 by proliferation inhibition of cultured cancer cells in vitro and of animal models in vivo. This study will clear the roles of LDH isoenzymes in Warburg effect and provide a possible new target for cancer therapy.

乳酸脱氢酶同工酶C（LDH-C）为癌症睾丸抗原，在肿瘤细胞中有广谱性高表达，可能与同工酶A（LDH-A）一样在癌细胞的有氧糖酵解（Warburg效应）途径中发挥重要作用。项目组前期通过系统筛选和RNA干扰实验发现，抑制LDH-A的小分子同时也抑制着LDH-C的活性，降低LDH-C的表达也能有效抑制肿瘤细胞的增殖，提示LDH-C可能是抗癌的潜在靶点。基于此，本项目拟开展：1）基于AutoDock软件，以LDH-A为对照，以LDH-C为靶点，完成小分子化合物的计算机虚拟初筛；2）利用原核表达系统，制备大量LDH-A4和LDH-C4蛋白，通过体外酶动力学分析对虚拟筛选结果进行复筛；3）通过体外和体内不同水平的肿瘤抑制实验，评价选择性抑制LDH-C活性的小分子化合物对肿瘤细胞增殖的抑制效果。本项目的开展将阐明不同乳酸脱氢酶同工酶在Warburg 效应中的作用，同时也为抗癌药物新靶点的发现提供可能。

乳酸脱氢酶同工酶C（LDH-C）为癌症睾丸抗原，在肿瘤细胞中有广谱性高表达，LDH-C与同工酶A（LDH-A）一样在癌细胞的有氧糖酵解（Warburg效应）途径中发挥重要作用，但目前国内外对LDH抑制剂的研究几乎都集中在LDH-A上，对靶向LDH-C的抗肿瘤研究还鲜见有报道。本项目利用分子对接技术，以LDH-C为靶点，LDH-A为对照，通过计算机初筛和体外的酶动力学复筛获得了12个微摩尔级别的特异性抑制LDH-C4酶活力的小分子化合物，其中4个小分子化合物的KD值小于7uM 。通过基因定点突变和原核表达纯化技术，项目组熟练掌握了人LDH-A4和LDH-C4蛋白的大肠杆菌表达制备流程，获得了大量人LDH-A4和LDH-C4的活性蛋白。同时，本项目通过酶联免疫吸附实验和定量PCR技术，证实LDH-C和LDH-A一样，在肿瘤患者的血液细胞中也存在广谱高表达；通过免疫组化实验和组织芯片技术，证实LDH-C在肺癌患者的癌组织和癌旁组织之间的表达差异具有统计学意义（p<0.05）；通过RNA干扰技术，证实特异性干扰肺癌细胞A549中LDH-A和LDH-C表达，都能有效抑制A549的细胞增殖；通过在肺癌肿瘤动物模型中过表达LDH-C，证实过表达LDH-C可促进肿瘤组织的生长；这些进一步验证了LDH-C也是抗癌的潜在靶点。此外，项目还在通过双位点突变（55Leu+331Ile/55Glu+331Gln）获得大量人LDH-C4的可溶性表达的基础上，进一步制备了蛋白晶体，通过X射线衍射技术获得了分辨率为3Å的带辅酶NAD和抑制物N-Ethyl oxamate的LDH-C4的蛋白结构。该结构解析填补了目前PDB数据库中没有人LDH-C蛋白结构的数据空白，为深入了解LDH-A和LDH-C两种蛋白结构和功能差异奠定了基础。综上，本项目的开展将阐明不同乳酸脱氢酶同工酶在Warburg效应中的作用，同时也为抗癌药物新靶点的发现提供可能。