利用人工miRNA靶向甘蔗病毒沉默抑制子改良甘蔗抗病毒特性

病毒编码的RNA沉默抑制子（RSS）是抵抗植物转录后RNA沉默的有效策略，通过人工miRNA靶向RSS可以提高植物抗病性。我国各蔗区甘蔗病毒病害发生日趋严重，急需改良商业品种抗病毒能力。本课题在研究甘蔗主要病毒编码的RSS在自然寄主甘蔗上的作用机制基础上，分别选取甘蔗病毒RSS基因21 nt保守序列代替拟南芥内源miR319a的成熟序列，并将人工miRNA串联连接于植物表达载体上，通过基因工程技术把含有病毒靶标序列的人工miRNA导入甘蔗细胞，经分子生物学鉴定获得甘蔗转基因植株。利用实时荧光RT-PCR和Northern杂交等技术分析人工miRNA在转基因甘蔗植株上的表达水平，结合抗病性鉴定和工农艺经济性状指标，培育出广谱抗病毒转基因甘蔗优异种质。本课题以甘蔗病毒RSS分子作用机理为切入点，利用人工miRNA靶向RSS改良甘蔗抗病毒特性的策略为甘蔗抗病毒分子育种提供一种新思路和新方法。

甘蔗病毒病是我国蔗区主要病害，发生日趋严重，导致产量和含糖量下降。病毒编码的RNA沉默抑制子（RSS）是抵抗植物转录后RNA沉默的有效途径，将靶向RSS的人工miRNA载体通过转基因手段导入植物基因组，可以提高植物的抗病性。本项目首先克隆我国主要蔗区存在的SCYLV、SCSMV、SrMV和SCBV等甘蔗病毒全长基因组及沉默抑制子基因序列，揭示这些病毒在国内蔗区的分布、遗传多样性和分子进化机制。我国蔗区甘蔗病毒存在丰富的遗传多样性和显著的群体遗传结构，遗传重组是主要的进化动力之一。其次，解析SCYLV-P0、SCSMV-P1、SrMV-P1/HC-Pro和SCBV-Orf1沉默抑制子在模式植物本生烟及自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的活性和功能，初步探索沉默抑制子与植物蛋白互作的分子机制。最后，分别选取SCYLV-P0、SCSMV-P1、SrMV-P1/HC-Pro和SCBV-Orf1沉默抑制子基因21 nt保守序列替代水稻miR528a的成熟序列，单独或两两串联并连接至植物表达载体上，采用基因枪轰击技术遗传转化甘蔗心叶愈伤组织，获得27株SCYLV+SrMV和SCYLV+SCSMV转基因植株。经过带毒蚜虫和感病叶片粗提液摩擦接种的方式评价鉴定对甘蔗病毒的抗性，筛选出同时高抗SCYLV、SrMV、SCSMV病毒的甘蔗新材料3份，为甘蔗抗病毒育种储备一批抗性转基因新材料。以上研究成果在国内权威期刊发表学术论文7篇，其中SCI收录5篇；获得国家发明专利授权7件；培养了2名硕士研究生。