基于糖蛋白质组学的鸡蛋清糖肽致敏原鉴定及其致敏机制研究

Chicken egg white is one of the major food allergens, because of its wide application in dietary and food processing, it is difficult to avoid contact allergy, thus become a major threat to allergy sufferers. Current research on egg white allergenic proteins are more attention to its peptide segment, while the role of glycosylation and glycan moieties in the allergenicity is not yet clear. The project intends to systematically study the egg protein glycoproteomics using proteomics method, and chooses egg white glycopeptides as the research object, clarifies its allergenicity mechanisms and structure-activity relationships. First, using mass spectrometry and two-dimensional electrophoresis to characterize the glycosylation of chicken egg white glycoproteome, identify egg white glycoproteins, glycosylation sites and glycan chain structure. Based on this, obtain glycopeptides from egg white glycoproteins through in vitro digestion system, and screened allergenic glycopeptides by IgE binding experiments, then characterize its structure by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. Study the allergenic mechanisms of glycopeptides using animal models (in vivo). Furthermore, demonstrate the structure-activity relationship through studying the allergenicity of directionally modified glycopeptides, and clarify the role of glycan c moieties in the allergenicity. The project will characterize the glycosylation structure of chicken egg white proteins, improve the theory of egg allergenicity, and provide scientific basis for the study of egg desensitization therapy.

鸡蛋清是重要的食品过敏原之一，由于其在膳食和食品加工中应用广泛，难以避免接触，成为过敏患者的重要威胁。目前鸡蛋清致敏蛋白的研究多关注其肽段部分，而其糖基化修饰及糖链在致敏中的作用尚不明确。本项目拟运用组学方法系统研究鸡蛋清糖蛋白质组，并以鸡蛋清致敏性糖肽为研究对象，对其致敏机制和构效关系进行深入探讨。首先采用二维电泳和生物质谱等方法对鸡蛋清糖蛋白质组进行系统分析，获得糖蛋白种类、糖基化位点和糖链结构等信息；在此基础上，以鸡蛋清糖蛋白体外模拟消化产生的糖肽为对象，通过特异性IgE结合实验筛选出致敏性糖肽，并利用质谱和核磁共振对其结构进行解析；采用小鼠动物实验模型研究其致敏机制，并进一步通过对糖肽结构的定向修饰，阐明其致敏的构效关系，明确糖链部分在致敏中的作用。通过本项目的开展，以期补充鸡蛋清糖蛋白糖基化结构信息，完善鸡蛋清致敏相关理论，并为脱敏方法的研究提供科学依据。

项目首先基于修饰多肽富集技术和液相色谱-质谱（LC-MS/MS）技术，对鸡蛋中的糖基化修饰蛋白质组进行了系统研究。在鸡蛋蛋清N-糖蛋白质组分析中，共鉴定到26个糖蛋白，包含71个N-糖基化位点，序列分析显示，蛋清N-糖基化位点中N-X-T占比为55%，N-X-S占比为32%；在鉴定到的26种蛋清糖蛋白质中，卵粘蛋白的N-糖基化位点最多，达到16个；卵簇蛋白在二维电泳凝胶上表现为横向分布的系列蛋白点（pI 4.54-6.68），其糖基化显示出显著的不均一性。此外，针对研究中发现的糖基化修饰不均一性、非保守序列修饰位点、同源蛋白修饰位点的多样性、修饰与家鸡驯化的潜在相关性等科学问题，作者亦进行了深入的讨论。基于蛋清糖蛋白质组鉴定结果，发现蛋清卵白蛋白的糖肽丰度最高，因此，研究并建立了蛋清卵白蛋白的纯化方位，以为后续糖肽富集的开展提供样品原料。通过探明卵白蛋白在水相溶液中的溶解-沉淀规律，攻克了鸡蛋清中主要蛋白质（卵白蛋白）的快速、大规模、低成本制备方法。优化获得的纯化最佳工艺为：聚乙二醇浓度为15%、溶液pH值为6.5、盐离子浓度为50 mmol/L、温度为10°C。在此条件下，卵白蛋白的纯度达到约90.13、得率为约50%。在此基础之上，建立体外模拟消化方法和糖肽富集方法。通过研究优化，得到胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶三种酶复合酶水解，对蛋清的模拟消化效果最佳。基于亲和层析对蛋清水解产物中的糖肽进行富集，发现经0.2与0.5 mol/L的α-D-甲基甘露糖苷的缓冲液，可将亲和层析填料上富集到的蛋清糖肽洗脱。对富集到的糖肽进行鉴定，发现蛋清中的高丰度糖肽主要来自卵白蛋白、卵转铁蛋白和卵类粘蛋白。最后，进一步利用脂多糖诱导小鼠产生败血症，建立体内炎症模型，系统评估蛋清糖肽对体内炎症的作用，并研究蛋清糖肽对相关细胞因子的调控作用。基于研究结果，初步明确了蛋清糖肽通过抑制炎症参与调控致敏过程和致敏症状的潜在机理。