骨关节炎软骨细胞外基质破坏中机械应力－生物信号－效应分子通路的进一步探索

Osteoarthritis (OA) is an most common joint disease elderly with the characterized articular cartilage deg-radation. Our previous work successfully established the chondrocyte/agarose solid three-dimensional cul-ture model for mechanical load and find the optimal concentration of chondrocytes 106cells/mL, agarose 2.5%, and best pressure conditions 30kPa, 0.33Hz for 15min, 30min, 60min and 120min. The results show the mechanical stress significantly increased chondrocytes expressing MCP-1, reduced the expression of MMP-1, verapamil decreased both MCP-1 and MMP-1 expressions; but no significant effect on MMP-3, -13. The literature reported the aggrecanases play a more important role in the destruction of the articular cartilage, and about three weeks earlier compared with MMPs. The inhibition of aggrecanase-1, -2 can ef-fectively prevent the damage of articular cartilage. Therefore, the next step of our works, This model will be loaded using Flexcell 4000 pressure, and the real-time quantitative RT-PCR, ELISA, immunestaining and western blot are applied to focus on the mechanism for the increase in MCP-1 andaggrecanases,the presence of coupled calcium channels/CD44 molecular and and the synthesis of collagen type Ⅱ and proteoglycans pericellular matix of the model.

骨关节炎（OA）是一种老年人最常见的关节疾病，以关节软骨进行性破坏为特征。我们前期工作中，成功建立了软骨细胞/琼脂糖三维培养施压模型，探索出软骨细胞106cells/mL、琼脂糖2.5%的最佳浓度，30kPa、0.33Hz施压参数，以及施压时间15min、30min、60min和120min。结果显示，机械压力显著增加软骨细胞MCP-1表达、减少MMP-1表达，维拉帕米则同时减少MCP-1和MMP-1表达；对MMP-3、-13无显著影响。文献报告，蛋白聚糖酶-1和-2在关节软骨破坏中起更重要的作用，与MMPs比较大约提前3周。因此，本研究下一步工作，采用该模型通过Flexcell 4000施压，采用实时定量RT-PCR、ELISA、免疫组化、免疫印迹等方法重点探讨MCP-1和蛋白聚糖酶表达机制、钙离子通道和CD44藕合分子的存在，以及该模型中软骨细胞周围Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成。

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是中老年人最常见的骨关节病，随着人口老龄化日益加重，OA所致的长期、慢性关节疼痛，给老年人日常生活带来了极大的困扰。除磨损造成的软骨直接损伤外，软骨细胞外基质合成与分解失衡是OA发病机制之一。本研究采用Flexcell FX-5000TM细胞加力仪对骨关节炎软骨细胞-琼脂糖模型施压，以及维拉帕米干预，研究机械应力和维拉帕米对软骨细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原代谢的影响，为OA治疗方法的研究提供新思路。入选行关节置换术的膝OA患者，取胫骨平台软骨，分离软骨细胞，制作软骨细胞-琼脂糖三维模型。采用Flexcell FX-5000TM细胞加力仪施压，维拉帕米干预浓度设定40μmol/L。采用RT-PCR和Western Blot法检测软骨细胞-琼脂糖三维模型蛋白聚糖、ADAMTS-4, ADAMTS-5, CollagenⅡ, MMP-1, MMP-3和MMP-13 mRNA和蛋白水平，ELISA法检测上清液中上述蛋白的水平。结果：1.适当的机械应力可促进OA软骨细胞/琼脂糖AGC合成代谢，抑制ADAMTS-5生成，且在一定的压力变化范围内（0kPa-24kPa），随着压力增加，AGC生成增加，ADAMTS-5生成减少。2.机械应力（0kPa-24kPa）对OA软骨细胞/琼脂糖ADAMTS-4的表达无影响。3.维拉帕米（40μmol/L）单独或者与机械应力联合均可促进软骨细胞AGC合成，抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5生成。4.机械应力（24kPa）可促进软骨细胞CollagenⅡ合成，抑制MMP-1和MMP-13生成，MMP-3变化趋势不明显。5.维拉帕米（40μmol/L）可抑制MMP-1, MMP-3和MMP-13生成，促进软骨细胞CollagenⅡ合成，联合机械应力可进一步加强促CollagenⅡ合成作用。