基于单链核苷酸链劫持Ku蛋白介导的全新DNA双链断裂替代修复途径模型的新型修复蛋白鉴定

DNA double strand breaks(DSBs) are considered to be the most detrimental lesions for genomic integrity. In mammalian cells, non-homologous end joining（NHEJ）which involves key repair proteins like Ku，DNA-PKcs，XRCC4，DNA ligase IV as main players. In the last decades, an alternative end-joining(A-EJ) pathway has emerged, which is independent of NHEJ core proteins and is characterized as highly mutagenic, directly related to tumorigenesis. Since it’s a marginal, pathological pathway, and, in most case, is suppressed by NHEJ, the proteins participated is far from being understood. In previous work, we unveiled that Ku protein may be the key factor for the choice of two pathways. Based on this hypothesis, we successfully established a unique A-EJ model mediated by single-stranded DNA oligomers (ssO) hijacking Ku. This significant finding has been tested in in vitro condition and has produced a great publication. In this project, based on this model, first, we aim to test this model works in both solid tumor cells and hematological tumor cells. Second, we will identify potential proteins participated A-EJ pathway. Finally, we will demonstrate the potential proteins participate in the repair process. We aim to decipher more molecular target in this cancer related repair pathway and provide alternative options for future development of new drugs fighting cancer.

DNA双链断裂可对细胞基因组的完整性造成严重破坏。哺乳动物细胞主要使用经典非同源末端连接（NHEJ）来进行DNA双链断裂修复。近年发现了一条隐秘的不依赖于NHEJ的替代修复途径(A-EJ)与肿瘤发生紧密相关，因其通常被NHEJ掩盖，且两种途径选择机制尚存争议，故对其修复机制与参与蛋白尚未完全探明。我们前期发现Ku蛋白可能是细胞选择NHEJ和A-EJ的关键性决定因子，进而开创性地使用了短单链核苷酸链劫持Ku蛋白离开DNA断端，成功迫使细胞放弃NHEJ而转向A-EJ，在细胞内外均证实了此方法可作为一种全新、高效的A-EJ研究模型，在国际上首次报道。本项目拟基于该高效研究模型的雏形，在实体肿瘤和血液肿瘤（敏感和耐药株）中验证其普适性，并进一步筛选A-EJ候选参与蛋白，最后鉴定出两类肿瘤细胞中参与替代修复途径的关键蛋白。旨在发现参与该致癌途径的新型修复蛋白，为未来肿瘤靶向药物开发提供新的分子靶点。

DNA双链断裂修复通路除已有深入研究的经典非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）外，还存在一条不依赖于上述通路的替代修复途径（A-EJ）。作为近年来新发现的一条修复通路，它常被经典通路压制与掩盖，但其与肿瘤发生密切相关。然而其修复机制和参与该通路并发挥作用的蛋白尚未完全探明，研究较少。为了筛选参与A-EJ途径且尚未被鉴定的修复蛋白，并研究其在肿瘤中的作用，本项目从三个方面开展研究：①基于Ku蛋白为NHEJ 和A-EJ 通路选择的关键因素，利用单链寡核苷酸（ssO）劫持Ku蛋白离开DNA的方法，在实体肿瘤（肺癌）和血液系统肿瘤（慢性髓细胞白血病）细胞株中建立A-EJ途径的体外模型，并验证其普适性；②通过蛋白质谱分析筛选可能参与A-EJ途径的候选蛋白；③验证候选蛋白是否参与替代修复途径以及研究该蛋白在实体肿瘤和血液瘤耐药中的作用。结果表明：①在体外，ssO均可通过劫持NHEJ途径中的Ku蛋白，阻止Lig4、DNA-PKcs等关键蛋白募集到DNA断端，并同时增加A-EJ蛋白群在DNA断端的募集。说明该模型可作为一个成功且高效的普适A-EJ平台支持后续研究，克服了A-EJ模型难以建立的难题。②基于该模型，将A-EJ途径中募集到DSBs端的蛋白群进行质谱检测，并进一步筛选出可能参与A-EJ途径的候选蛋白EXO1以及RBMX。尚无文献证据表明该候选蛋白参与A-EJ 通路，其他蛋白暂列入课题下一步计划。③通过蛋白质分层提取以及c-NHEJ/HR/A-EJ途径的报告质粒实验方法首次验证EXO1可不依赖于Ku蛋白而募集到DNA 断端，为参与A-EJ途径的新蛋白；而RBMX并非参与A-EJ 通路，但可通过调控BRCA2的表达参与HR修复途径。分别抑制EXO1和RBMX的表达可能增加实体瘤和血液瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。综上，本项目成功在体外构建A-EJ模型，进一步验证了该模型的普适性和可靠性，并通过该模型筛选出参与A-EJ途径的新型修复蛋白EXO1。RBMX可通过调控HR通路中重要蛋白分子BRCA2转录水平进而影响BRCA2与Rad51在DSBs结合的稳定性而发挥作用。靶向EXO1和RBMX可增加耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，其有望作为治疗肿瘤耐药患者的潜在靶点。