细胞骨架对植物膜蛋白运动形式与内吞作用调控机制的研究

The plasma membrane plays an extremely important role in the life activities of cell and its functions depend on the unique restless membrane protein molecular dynamics. Studies on molecular dynamics of membrane proteins will advance our knowledge of how the plasma membrane performs its function. Cytoskeleton is an important regulator of plasma membrane organization and dynamics, which was found to play an important role in membrane protein motility and endocytosis in animal cells. However, the regulatory mechanism of cytoskeleton on membrane protein motility and endocytosis in plant cells remains to be further investigated. In the present study, we will determine the distribution pattern, motility parameters and endocytosis pathway of four representative plant membrane proteins by using of some new methods and techniques including variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence cross-correlation spectroscopy. Then, cytoskeleton specific inhibitors as well as cytoskeleton mutant Arabidopsis will be used to explore the effect of cytoskeleton on plant membrane protein motility and endocytosis. The role of cytoskeleton on different endocytosis pathway will also be revealed. The results of this study will provide important clues about the regulatory role of cytoskeleton in plant membrane protein motility and endocytosis, it will lay foundation for the further investigation of molecular mechanisms of dynamic change in plant plasma membrane.

细胞膜在细胞的生命活动中起重要的作用，其功能的实现离不开质膜上蛋白分子的动态变化，膜蛋白分子动力学及其影响因素的相关研究对全面解析细胞膜的功能具有重要的意义。细胞骨架是细胞质膜组织与动态的重要调节因子，在动物细胞膜蛋白运动以及内吞过程中起重要的调控作用，然而，植物细胞中的相关研究尚非常有限。本项目针对前人工作的不足，着重选取有代表性的四种植物膜蛋白，采用可变角度的全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、荧光互相关光谱等新方法、新技术，对这些蛋白在质膜上的分布模式、运动参数及内吞规律进行分析。在此基础上，结合细胞骨架特异性抑制剂药理学处理和细胞骨架突变体，观察并分析细胞骨架对这些膜蛋白在质膜上的运动以及内吞作用的影响，阐明细胞骨架在植物膜蛋白不同内吞途径中的作用。研究结果将为细胞骨架在植物膜蛋白运动和内吞过程中的调控机制提供重要线索，为进一步揭示植物细胞膜动态变化的分子机理奠定基础。

细胞膜主要由膜脂和膜蛋白组成，细胞膜蛋白种类繁多，是生物膜功能的主要承担者。细胞膜功能的实现离不开质膜上蛋白分子的动态变化，膜蛋白分子动力学及其影响因素的相关研究对全面解析细胞膜的功能具有重要的意义。细胞骨架是细胞质膜组织与动态的重要调节因子，在动物细胞膜蛋白运动及内吞过程中起重要的调控作用。然而，植物细胞中的相关研究却非常有限。本项目选取了有代表性的四种膜蛋白，综合运用可变角度全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、荧光互相关光谱以及FLIM-FRET等技术，对这些蛋白在质膜上的分布模式、运动参数等动力学特征和内吞状况进行了分析。结合细胞骨架特异性抑制剂，观察并分析了细胞骨架对这些膜蛋白在质膜上运动特征的影响，并进一步分析了对这些膜蛋白相关功能的影响。结果表明：膜筏标记蛋白AtHIR1的运动被局限于微管形成的隔区内，其运动在一定程度上也受到微丝骨架的影响。质膜上AtHIR1存在同源寡聚化，破坏细胞骨架和膜筏后，膜上AtHIR1的密度增大、寡聚化程度降低。破坏细胞骨架或膜筏使AtHIR1在flg22诱导的复合体中的含量显著降低，同时可以显著地降低AtHIR1及其复合体成员AHA2之间的相关性。因此推测AtHIR1可以以脚手架的形式招募免疫相关蛋白，促进相关免疫复合体的形成，而该过程需要完整的细胞骨架和膜筏。对ATP受体蛋白AtDORN1的研究表明，ATP使AtDORN1-GFP的运动范围变小、扩散系数降低。微管骨架的破坏抑制了ATP诱导的AtDORN1的动力学变化，使其扩散系数显著增加，同时减弱了ATP诱导的下游Ca2+浓度的升高。此过程中，微丝骨架没有明显改变AtDORN1在质膜的扩散系数，同时，对AtDORN1响应ATP后的Ca2+的变化也没有影响，因此，微管骨架在AtDORN1介导的ATP信号传导中发挥主要功能。此外，微管的破坏增大了介导内吞作用的网格蛋白的运动轨迹和扩散系数，而对于多胺转运蛋白的动力学特征，则没有显著的改变。本项目的开展，为揭示细胞骨架调控不同植物膜蛋白动力学的机理提供了重要线索，也为进一步解析细胞骨架调控不同细胞膜蛋白所涉及生物学功能的研究奠定了基础。