AtHIRs促进膜筏形成并参与植物免疫反应调控的研究

Membrane rafts are considered to function as platforms for various cellular processes, including immune signaling of plant cells. HIRs (hypersensitive induced reaction) proteins, which are plant-specific members of the SPFH protein superfamily, are found to present at the plasma membrane in spatially limited microdomains. However, the functions of HIRs in the formation of membrane rafts and recruiting immune proteins to membrane rafts, as well as the regulation mechanism involved remain to be further elucidated. Based on our findings in the previous investigations, we will apply variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM)，fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), protein-protein interaction (PPI) and fluorescence lifetime imaging microcopy-fluorescence resonance energy transfer (FLIM-FRET), to investigate the mechanism of AtHIRs involved in plant immunity. First, we will identify the AtHIRs complex and analyze its role in the formation of membrane rafts. Then we will analyze the changes of AtHIRs in plasma membrane especially the exocytosis changes upon immune recognition. Finally, we are going to investigate the recruitment of immune proteins in the HIRs membrane rafts during the immune responses. Taken together, the results of this study will lay foundation for revealing the regulation mechanism of AtHIRs served as scaffold proteins in the formation of membrane rafts and involved in the plant immune responses.

膜筏参与包括病原菌防御反应在内的多种生理活动，被认为是膜蛋白进行生化反应和发挥生理功能的平台。过敏性诱导反应蛋白HIRs是植物中特有的含有SPFH结构域的蛋白，锚定于膜筏微区。作为典型的脚手架蛋白，HIRs是否参与及如何参与膜筏形成，并在膜筏微区招募免疫相关蛋白而调控植物免疫反应的机制尚不明晰。基于我们前期研究中的发现，本项目拟采用可变角度全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、荧光寿命成像-荧光共振能量转移、蛋白接近指数分析等新技术，对拟南芥AtHIRs如何参与膜筏形成并调控植物免疫反应的机制进行研究：（1）鉴定AtHIRs复合体组分并分析其在膜筏形成中的作用；（2）分析拟南芥免疫反应过程中质膜AtHIRs的变化及其胞吐作用参与免疫调控的机理；（3）阐释AtHIRs对植物抗病蛋白在膜筏定位的影响及其在植物免疫中的作用，旨在揭示AtHIRs作为脚手架蛋白组织膜筏形成并参与植物免疫反应的调控机制。

膜筏被认为是膜蛋白进行生化反应和发挥生理功能的平台，在细胞多种生理活动中发挥重要的作用。过敏性诱导反应蛋白HIRs是植物中特有的具有SPFH结构域的蛋白，该家族蛋白作为典型的脚手架蛋白，锚定于膜筏微区，与膜筏的形成密切相关并在植物免疫、离子转运及非生物胁迫过程中发挥重要功能。本项目围绕AtHIRs组织膜筏形成并招募相关蛋白发挥生物学功能而展开研究，综合运用可变角度的全内反射荧光显微术（VA-TIRFM），结合单颗粒示踪、波动曲线记录（Kymograph）分析及激光扫描共聚焦显微镜分析，证明AtHIR1、AtHIR2和AtHIR4主要定位于细胞质膜，具有相似的动力学特征，存在共定位和共扩散现象；AtHIR3则主要呈不连续状定位于液泡膜，同时，质谱检测结果表明AtHIRs家族成员位于同一个复合体。随后，通过膜微区相关染料di-4-ANEPPDHQ染色，发现与野生型拟南芥相比，Athir1Athir2Athir4突变体的膜有序度明显降低。BFA处理及洗脱实验表明AtHIR1、2、4存在胞吐作用，并通过AtSYP121依赖的方式胞吐上膜。对于Athir1Athir2Athir4突变体的抗病性分析表明，flg22引发产生的ROS在突变体中明显降低，同时，突变体对于DC3000的侵染更敏感。进一步的研究发现AtHIR1、2、4复合体中有多个抗病相关蛋白，表明AtHIRs在细胞质膜上形成复合体，有助于有序度较高的微区的形成和免疫相关蛋白的膜筏定位与功能。液泡膜微区定位的AtHIR3复合体中存在VHA的多个亚基，双分子荧光互补、酵母双杂交以及蓝绿温和胶实验证明AtHIR3和AtVHA-A互作。Athir3突变体中，AtVHA-A-EGFP的扩散系数和运动范围均大于野生型，说明AtHIR3蛋白与VHA-A蛋白互作，招募其进入液泡膜筏微区而影响其功能。本项目的开展，为进一步深入阐明膜筏微区这一功能平台参与植物免疫调控及其他相关生物学功能调控的机理提供了新的依据。