中药注射剂过敏原的在线高效分离-鉴定-半抗原/类过敏检测系统的建立和致敏形成机制的研究

Traditional Chinese Medicine Injection (TCMI) is an symbolic achievement of traditional Chinese medicine. However, growing numbers of reports on its allergic reactions have led to serious social events and endanger public trust of TCMI, and thus the allergic reactions of TCMI have become an urgent issue of pharmaceutical industry. Though the small molecular allergens are known to be essential in those allergic reactions, the systematic research on the sensitization mechanism and efficient study method are still the two key points in this field. Based on our previous studies, this project proposes an innovative platform for allergen screening in TCMI based on “on-line high-performance liquid chromatography-mass spectrometry- haptens/allergies detection system”. Applying this platform, efficient separation, structure identification and measurement of sensitization activity of the potential allergenic components in TCMI will be achieved first, followed by corresponding animal models will be used for confirmation of allergens and study of their mechanism of actions. This platform is comprehensive, systematic, efficient, sensitive and precise, and thus will significantly increase the study efficiency and minimize the false-negative allergens in TCMI. This project provides new ideas and methods for screening allergens in TCMI systematically and revealing their mechanism of actions, therefore it is of extreme importance for guiding the manufacturing and clinical application of TCMI, ensuring patients’ safety and regaining public confidence on TCMI.

中药注射剂(TCMI)是中医药的标志性成果，但临床不良反应报道严重地影响到用药安全和社会信任度，成为亟待解决的重大问题。TCMI不良反应的根源是小分子过敏原，其致敏形成机制不清和研究手段匮乏是目前系统阐明TCMI中过敏原所面临的理论和技术层面的两大关键问题。本项目在前期研究基础上，提出建立以“在线HPLC-MS-半抗原/类过敏原检测系统”为依托的TCMI过敏原创新研究体系，实现TCMI中疑似过敏原的高效分离、结构鉴定和活性测定，再以动物模型确认其中过敏原成分，同时对过敏原的致敏形成机制进行系统研究。该体系可大幅提高研究效率并避免TCMI中过敏原漏筛，为系统研究TCMI中过敏原成分、阐明致敏形成机制和预测致敏成分提供新的思路和方法，对指导TCMI生产和临床应用、保障患者安全和重拾社会信心具有十分重要的意义。

中药注射剂(TCMI)是以中医理论为指导，运用现代科学技术和方法，从中药或复方中药中提取的有效物质，是现代中医药研究的标志性成就。TCMI在临床应用中发挥着重要作用，特别是针对危重疾病的治疗。但由于TCMI成分复杂、质量标准不完善、临床使用不合理，导致临床不良反应频发，不仅对患者的生命健康造成了严重危害，而且产生了极其恶劣的社会影响，引发大众对TCMI乃至整个中医药的信任危机。因此，TCMI引起的不良反应已成为我国中医药领域亟待解决的重大问题。.本研究采用HPLC-DAD-ESI-IT-TOF-MS-HSA-FLD系统对香丹注射液(XDI)和清开灵注射液(QKLI)中的化学成分进行高效分离，结构鉴定和HSA结合活性测定。从XDI中分离鉴定出21个化合物，包括5个氨基酸、1个糖、1个有机酸、2个核苷、12个酚酸。从XDI中筛选出9个HSA结合活性化合物。从QKLI中分离得到84个化合物，鉴定出65个化合物，包括9个氨基酸，12个有机酸，1个碳水化合物，6个酯类，5个糖苷，10个环烯醚类化合物，8个黄酮类化合物，15个胆酸。其中19个化合物为首次在QKLI中发现。从QKLI中筛选出6个HSA结合活性化合物。.本项目采用SPR技术对HSA有结合活性的小分子化合物进行筛选。并采用小鼠乳腺细胞瘤细胞P815细胞的脱颗粒实验进行验证。另一方面，将HSA结合的小分子成分与血清孵育，制备相应的半抗原复合物，用于SD大鼠和豚鼠进行ASA实验，观察动物症状。对这些通过在线方法筛选出的潜在过敏原进行细胞实验和动物过敏验证加以确认。.本项目首次构建了在线UPLC-PDA-MS2-RhoA-FLD蛋白活性分析系统。我们将该系统应用于灯盏细辛注射液（DZXXI）中类过敏原成分的研究。共鉴定出55个小分子化合物，其中黄酮类及黄酮苷类26个，苯丙素类6个，酚酸5个，香豆素类2个，醌类3个，其他13个。筛选出与RhoA蛋白结合的小分子化合物29个。在此基础上，选取DZXXI中的绿原酸、隐绿原酸、木犀草素、黄芩素进行小鼠耳廓蓝色染色实验。实验结果表明DZXXI中含有的木犀草素类成分与类过敏反应的发生有关。