A型肉毒素重链刺激神经突起再生机制的研究

A型肉毒素是一种极强的生物毒素，主要通过与突触前膜相应膜受体结合入胞、裂解突触囊泡蛋白SNAP-25而阻断神经递质释放、引起肌肉麻痹。目前临床上常采用极小剂量A型肉毒素局部注射治疗一些与肌肉收缩紊乱有关的病症。A型肉毒素注射后期局部常伴有新的神经末梢形成，且体外实验也发现A型肉毒素或其重链本身均可直接刺激神经突起增长及分支数目增多，但是这种促神经突起增生的机制并不清楚。由于A型肉毒素重链及髓磷脂抑制因子?髓鞘相关蛋白（MAG）膜结合受体结构中均含有三涎酸神经节甙脂（GT1b），因此本项目旨在探讨A型肉毒素重链是否通过与GT1b结合阻断或拮抗MAG与GT1b的结合、或抑制/干扰MAG相关细胞内信号通路（RhoA-Rock II-MLC）功能活性而达到刺激/促进神经突起再生的作用，由此阐明A型肉毒素重链刺激神经突起再生的机制、为临床寻找有效促进中枢神经系统再生的药物提供新的思路。

项目在体外细胞培养基础上，采用免疫荧光技术、免疫共定位、激光共聚焦、Western-blot、In-Cell-Westerb-blot等技术，对BoNT/A重链刺激神经突起的细胞及分子机制进行了探讨。结果：1）Neuro-2a细胞含有BoNT/A重链与宿主细胞结合高亲和力和低亲和力受体，可以作为研究BoNT/A重链作用的体外细胞模型。2）小剂量BoNT/A重链具有促进neuro-2a 细胞突起生长的作用，包括突起长度增加、突起的分支数量及具有突起的细胞占总细胞的百分比增多，且以BoNT/A重链剂量为0.1及1nmol/L表现最为明显。3）BoNT/A重链促进细胞内再生相关信号蛋白（Akt，ERK1/2）的磷酸化，提示BoNT/A重链促神经突起再生的机制可能是通过激活细胞内再生信号蛋白的磷酸化过程而实现的。 4）外源性给予GT1b 可以促进BoNT/A重链对Akt和ERK1/2磷酸化的激活，使Akt磷酸化高峰点前移。另外，采用lectin阻断GT1b后，BoNT/A重链激活Akt磷酸化的作用基本丧失。结果提示GT1b在介导毒素重链-蛋白受体入胞的过程中起着十分重要的作用。5）BoNT/A重链干预髓磷脂生长抑制相关信号通路的功能。细胞培养液内加入20noml/L的MAG可以抑制细胞突起的增长、使RhoA活性增强、激活ROCK-II磷酸化。单纯给予BoNT/A重链时，Akt及ROCK-II的磷酸化均呈现增强现象，但Akt磷酸化激活更为明显。因此，A型肉毒素主要通过激活再生相关信号通路促进神经突起的再生。以不同方式向培养液内分别加入MAG和BoNT/A重链（先后加入或同时加入）后，Akt、ERK1/2及ROCK-II的磷酸化的程度都有不同程度的降低。结果提示：BoNT/A重链与MAG可能在入胞时具有相互竞争抑制作用。6）在体外实验的基础上，利用改良的1ml注射器弯针复制大鼠一侧离断性腰段脊髓损伤的模型，并将A型肉毒素重链同时注射于损伤局部。结果表明，采用BoNT/A重链注射于脊髓损伤局部后1个月左右，尽管大鼠的运动和感觉功能尚未看到显著的改善，但是SDS-PAGE显示的结果提示BoNT/A重链的应用使损伤后局部某些分子量的蛋白谱表达的异常趋向正常化，表明BoNT/A可能干预脊髓损伤后局部蛋白组学的变化，值得进一步进行探讨。