EHD2沉默介导多效应耐药逆转的肿瘤生物学研究

Cancer Multidrug Resistance is the most challenging obstacle in cancer treatment. The key mechanism in MDR is related to ABC transporter up-regulation which mediates elevated drug effluxing. The current approaches of resistance therapy had not been successful, and more effective strategies are required to solve the problem. EHD2 has been found as the regulator of receptor endocytosis which mediates EGFR internalization and degradation, inferring that the up-regulation of MDR transcription could be blocked by interfering EHD2, which might also have extra-effects as well on MDR protein stability on the cell membrane. We present the hypothesis here that EHD2 might be an effective therapeutic target by which MDR might be reversed at multiple levels, i.e. EGFR-mediated MDR gene transcription block and MDR protein instability caused by EHD2 silencing.

肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是肿瘤化学治疗中的难题。多药耐药产生的主要机制为细胞膜上耐药蛋白表达增高并介导药物外排，对此开发的逆转耐药制剂的功效尚不理想。怎样在逆转耐药方面发现新机制新思路是肿瘤耐药治疗的当务之急。我们发现新膜转运调控蛋白 EHD2具有膜蛋白内吞调控功能，EHD2沉默后EGFR自发内吞并降解，提示EHD2沉默将可能下调EGFR信号通路并藉此下调EGFR通路介导的耐药基因转录。EHD2作为内吞调控蛋白还可能调控耐药蛋白的膜稳定性，我们的前期工作也显示了这种作用。本项目提出以EHD2为靶点施行表达沉默，期望起到多重耐药逆转的功效：即既在耐药基因转录水平通过阻断EGFR通路进行抑制，同时又对膜上定位的耐药蛋白的稳定性加以破坏，从而起到单靶多向的高效逆转肿瘤多药耐药的目的。

肿瘤的多药耐药现象是目前肿瘤药物治疗所面临的最大挑战，探讨肿瘤的多药耐药机制是肿瘤治疗的主要目标。ABC转运体能将化疗药物从细胞内泵出，对目前80%以上的肿瘤治疗药物具有药泵作用，是导致患者耐药的重要原因之一。EHD2是一种新型膜转运调控蛋白，有抑制多种膜蛋白和膜受体内吞的作用，从而稳定它们的膜定位和功能。蛋白组学研究发现EHD2与ABC蛋白相互作用。我们建立了多种耐药细胞系，经鉴定均为多药耐药细胞系，耐药细胞系群体倍增时间延长，单个细胞生长能力减弱，悬浮生长能力下降；经诱导耐药后，MCF-7/ADR中P-gp耐药蛋白明显升高、SKOV3/DDP中BCRP耐药蛋白以及EHD2表达明显升高，降表达EHD2后，耐药蛋白表达下降；免疫荧光显示在耐药细胞系中内源性EHD2表达量升高，并出现细胞膜富集现象，EHD2与p-gp、BCRP耐药蛋白分别在MCF-7/ADR、SKOV3/DDP细胞膜共定位；外源性EHD2蛋白与P-gp、BCRP在293T细胞膜共定位，并呈现囊泡特征；EHD2降表达后，MCF-7/ADR对阿霉素、SKOV3/DDP对顺铂的敏感性增强，P-gp药泵功能降低，细胞对底物Rh 123外排能力减弱；在癌组织中，耐药病例EHD2蛋白的表达要高于敏感病例，耐药病例中P-gp、BCRP耐药蛋白表达明显高于对照病例，并与EHD2的表达呈正相关；与低表达患者相比，EHD2高表达患者预后不良，3年生存率及总体生存时间均较差；裸鼠体内成瘤实验结果表明降表达EHD2裸鼠内移植瘤乳腺癌对阿霉素的敏感性增加；本课题在细胞水平上探讨了细胞耐药后EHD2及耐药蛋白的表达及定位变化，EHD2蛋白对细胞药物敏感性及药泵功能的影响，以及应用免疫组化在组织水平及动物水平进一步验证了其与耐药的关系，提示EHD2可能通过调控耐药蛋白的内吞影响其膜稳定性，从而介导肿瘤耐药；EHD2可能调控多种耐药蛋白的膜稳定性，为肿瘤药物敏感性分子指标的建立以及逆转耐药提供新方法、新思路。