CsdA 低温激活 rpoS mRNA 翻译的分子机制的结构生物学研究

CsdA, which belongs to DEAD-box protein family, is a cold-shock RNA helicase in E.coli. CsdA behaves as RNA-dependent ATPase and ATP-dependent RNA helicase. It was recently reported as an ancillary factor required for low temperature activation of RpoS synthesis by DsrA. The rpoS-encoded sigma subunit of RNA polymerase was considered to be activated in response to different environmental stress. The DsrA sRNA is an 87-nucleotide, untranslated RNA that helps to relieve an inhibitory stem-loop structure (iss) that impedes ribosome access to the rpoS rbs. Studies on CsdA indicated that it was required for low temperature synthesis of rpoS in vivo, therefore CsdA was proposed to unwind the duplex part of rpoS mRNA 5'UTR or DsrA. We are planning to employ multiple biophysical tools (NMR, X-ray crystallization) to investigate the structures of CsdA and CsdA/RNA complex. Also several in-vivo and in-vitro biochemical methods will be used to study the interaction of CsdA and RNA. The purpose of our research is to elucidate the structural and functional mechanism underlying low temperature rpoS mRNA regulation by CsdA in Escherichia coli.

CsdA是E.coli中具有RNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的RNA解旋酶活性的双功酶。低温下CsdA促进DsrA对RpoS翻译的激活。rpoS基因编码RNA聚合酶的sigma亚基，是大肠杆菌对应激响应的主要调节者。DsrA帮助打开rpoS mRNA分子内阻止核糖体结合的抑制性结构，使rpoS上的核糖体结合位点暴露出来。CsdA被推测具有解旋rpoS mRNA5'UTR或者DsrA的功能。目前蛋白/RNA复合物的结构解析非常困难，匮乏RpoS和DsrA如何调控CsdA的分子机制研究。因此我们解析了CsdA两个核心结构域独立的晶体结构，并通过小角衍射获得了整体的结构信息，测定了RNA依赖的CsdA蛋白的ATP酶活。拟进一步解析CsdA蛋白与RNA的复合物结构，检测体内外RNA对CsdA酶活的调控，阐明CsdA在低温下调控rpoS mRNA表达的分子机制。

CsdA属于DEAD-box蛋白质家族，是大肠杆菌中一种冷休克的RNA解旋酶，在低温下被诱导表达。CsdA具有RNA依赖的ATP酶活性和RNA解旋酶活性，可以在依赖ATP的模式下解离短RNA双链。CsdA参与50S核糖体的生物合成过程，缺失csdA基因导致低温下50S亚基的消失和40S亚基的积累。然而迄今为止，CsdA的结构以及C-端区域的功能仍未被解释。我们解析了CsdA两个核心结构域的晶体结构，第二个核心结构域的晶体结构包含了一段二聚体区域，发现二聚体结构域在维持CsdA稳定性及酶活功能方面起着不可或缺的作用。在此基础上，我们进一步解析了之前未被报道的RBD结构域的核磁结构，测定了CsdA依赖于RNA的ATP酶活和依赖于ATP的RNA解旋酶酶活，发现CsdA的C-端区域对调控CsdA酶活具有重要的影响。体内酶活实验表明CsdA二聚体结构域对于RpoS低温表达具有不可替代的作用。综合运用SAXS和19F-PRE方法，我们研究了CsdA在溶液中的整体构象，并研究CsdA核心结构域结合不同底物（RNA和/或ATP）时在溶液中的构象变化。我们还发现RBD结构域偏爱结合单链富含G的RNA，这将引导CsdA核心结构域解旋附近的双螺旋区域。因此我们阐释了CsdA C-端区域在CsdA结合RNA和发挥酶活中的重要作用，总体上出色地完成了本项目的预期目标，研究结果发表在Structure杂志上。