ASH1 mRNA定位翻译和降解的调控机制研究

在芽殖酵母中，ASH1 mRNA在子细胞芽尖的不对称定位表达决定了细胞交配类型的转换。我们的前期工作通过发现Puf6p，阐明了ASH1 mRNA在定位过程中的沉默机制。承接前期的研究结果，我们将进一步探讨ASH1 mRNA定位后翻译、储存和降解之间的相关机制，明确Puf6p和处理小体对ASH1 mRNA定位后表达的调控作用，发现和鉴定与ASH1 mRNA稳定、降解相关的蛋白因子；我们将结合新颖的蛋白荧光标记技术，在个体细胞水平上研究ASH1 mRNA从在母细胞核内转录到在子细胞芽尖定位以及Ash1p从定位后起始翻译到入核的动力学过程；并采用高灵敏，高分辨的荧光显微和分子影像手段从可视化的角度探讨mRNA定位表达的全过程和在这过程中各个步骤的协同调控机制。我们的最终目标是得以在活细胞中，在精确的时间和空间上实时观视ASH1 mRNA从转录，出核，运输定位，表达翻译到代谢降解的生命过程。

本课题的总体目标是探讨ASH1 mRNA 在子细胞芽尖定位后翻译，降解的调控机制。.在芽殖酵母中，ASH1 mRNA在子细胞的不对称定位表达决定了细胞交配类型的转换。前期工作中，申请人通过发现翻译抑制因子Puf6p，阐明了ASH1 mRNA从母细胞至子细胞传送定位过程中沉默的分子机制。承接前期研究结果，我们应用分子生物学和分子影像手段在个体细胞水平上研究ASH1 mRNA从转录起始到子细胞芽尖定位后翻译的动力学过程并探讨了ASH1 mRNA定位后的翻译调控机制。研究结果表明，虽然ASH1蛋白翻译发生在其mRNA被运输到子细胞芽尖，但是仍有相当部分的mRNA同Puf6p结合并处于翻译抑制状态。究其原因，我们发现了ASH1 mRNA的另一个结合蛋白：处理小体蛋白Dhh1p。Dhh1p在体内与ASH1 mRNA和Puf6p形成复合物且和ASH1 mRNA在子细胞芽端共定位。Dhh1p的失表达不但影响了ASH1 mRNA在子细胞的定位，同时解除了其对该定位后的mRNA的翻译抑制，造成ASH1蛋白的表达失控。进一步的研究显示，Dhh1p与ASH1 mRNA的5’UTR结合，这种结合在体外和体内抑制了ASH1 mRNA的翻译。我们的结果表明ASH1 mRNA的翻译调控不仅在其运输过程中，同时也发生在其定位后。而这种定位后翻译的协同调控机制是ASH1 mRNA与Puf6p和Dhh1p的相互作用。