马氏珠母贝植核育珠移植耐受免疫相关基因与蛋白质鉴定及关联度研究

Pinctada martensii is one of the most important Pearl oyster in pearl culture. Nucleus-inserting operation is the core part of pearl culture, and the graft rejection is the key limiting factor of nucleus-inserting operation. Which immune factors are involved in the process of transplantation immune tolerance is the key scientific question to be addressed in this project. Based on the genome data from pearl oyster Pinctada martensii we have completed, the aims of this study are to reveal the differential expression of functional genes in the process of nucleus-inserting operation and to select the key metabolism and signal transduction pathways through building transcriptome library at different stages of nucleus-inserting operation. Meanwhile, we will separate and identify the proteins in haemolymph using two-dimentinal electrophoresis and mass spectrum and select the proteins that are involved in the immunization in the process of nucleus-inserting operation by comparing the proteins in haemolymph using isobaric tags for relative and absolute quantitative (iTRAQ) technology. Furthermore, we will uncover and confirm the correspondence of the crucial genes and proteins that control the immunization by combining transcriptome library and proteome profiling, and study the functions of key genes we have screened by using rapid amplification cDNA end PCR、real-time quantitive PCR、RNA interference and western blot technologies and finally reveal the molecular regulation mechanism of immune tolerance of Pinctada martensii.

植核育珠手术是马氏珠母贝人工育珠最核心的环节，而移植排斥反应是植核是否成功的关键限制因子。到底有哪些免疫因子参与此移植耐受免疫过程，是本项目要解答的关键科学问题。本项目在前期已完成马氏珠母贝全基因组测序的基础上，拟借助转录组和蛋白质组等技术，构建马氏珠母贝植核后不同时期血淋巴的多个转录组文库，揭示免疫基因的差异表达并筛选关键通路，确定参与此过程的差异表达基因。同时，采用双向电泳和质谱鉴定方法对马氏珠母贝血淋巴的蛋白质进行分离和鉴定；运用同重同位素相对与绝对定量（iTRAQ）技术，对植核后不同时期血淋巴蛋白质进行定量分析，筛选植核育珠过程的免疫相关蛋白质。将转录组与蛋白质组的结果进行关联分析，发现并确认植核育珠过程中免疫关键基因与蛋白质的对应关系，运用RACE-PCR技术、荧光定量技术、RNA干扰和免疫印迹等方法对筛选到的关键基因进行功能研究，初步揭示马氏珠母贝耐受移植物的分子免疫机制。

植核育珠手术是马氏珠母贝人工育珠最核心的环节，而移植排斥反应是关系到植核是否成功的关键限制因子。到底有哪些免疫因子参与此移植耐受免疫过程，是本项目要解答的关键科学问题。.本研究以马氏珠母贝为研究对象，通过植核育珠手术培育珍珠。构建了马氏珠母贝植核育珠7个时期的血细胞转录组文库，将其合并为转录组文本集，共得到81,390个Unigene。与植核前相比，植核后5天、10天、15天、20天、30天和60天分别有3,345、6,846、4,636、4,167、4,716和6,679个差异表达基因，且在植核后第10天差异表达基因数目最多。不同时期的差异表达基因的KEGG富集中都有细胞粘附分子通路和原发性免疫缺陷通路。.利用iTRAQ技术并结合LC-MS/MS，对马氏珠母贝植核前、植核后10天、20天和30天的血细胞总蛋白质进行了相对与绝对定量分析，共采集到276,921张二级质谱图，鉴定到的肽段数目有24142条，鉴定到的蛋白质数目有2705个。分析了相邻采样点间差异表达蛋白。植核后10天的血细胞蛋白与植核前相比，有319个差异表达蛋白；植核后20天与10天相比，有167个差异表达蛋白；植核后30天与20天相比，有173个差异表达蛋白。从比较和动态的角度考察了差异蛋白的KEGG富集。在上述三组比较得到的319，167和173个差异表达蛋白中，有144、62和77个相应基因在转录水平上表现出一致的表达变化。.从马氏珠母贝植核后不同时期转录组和蛋白质组关联分析结果中，开发了与植核育珠有关的免疫基因12个：Toll样受体基因PmTLR6、PmTLR4、PmTLR13、肿瘤坏死因子受体相关因子PmTRAF7、热休克蛋白基因PmHSP20、PmHSP90、超氧化物歧化酶基因PmECSOD、C-型凝集素基因PmLec-8、清道夫脱帽酶基因PmDcpS、新型清道夫受体基因PmSR、天冬氨酸受体基因NR1、接头蛋白基因CIKS。对这些免疫基因在马氏珠母贝体内的组织表达差异性以及在多种应激（即热刺激、脂多糖刺激、植核育珠移植耐受应激和细菌刺激）条件下表达量的动态变化进行了研究。为了解上述基因在马氏珠母贝免疫体系中的作用机制奠定了基础，也为开发相关基因检测试剂盒和免疫抑制剂提供了科学依据，具有重要的研究意义和应用前景。