马氏珠母贝珍珠质形成相关microRNA的鉴定与功能研究

To deliberate the mechanism of nacre formation, tens of matrix proteins have been extracted from the nacre. However, the regulation mechanisms of these matrix proteins were not clear. MicroRNAs (miRNAs) are short nucleotide RNA molecules that negative regulators of gene expression in a variety of organisms. However, there were not related researches in Pinctada martensii. Based on our previous transcriptom database for pearl sac of Pinctada martensii, the aim of this study was to predict the related miRNA in nacre formation by bioinformatical method and characterize their expression using RT-qPCR, in situ hybridization and northern blot. Furthermore, we will explore their role and mechanism in the regulation of nacre formation by interference the miRNAs expression in vivo. This study would not only provide new insights into the mechanism of nacre formation, but also pave the way for further defining the functions of miRNA in biomineralization and other various biological phenomena in Pinctada martensii.

为了阐述珍珠质的形成机制，研究者已从中分离和克隆了数十种基质蛋白，但对这些基质蛋白的时空表达调控机制还不清楚。MicroRNA（miRNA）是广泛存在于生物体细胞内，具有强大的调控基因表达作用，并参与多种生物学功能调节的单链RNA分子。但是基于马氏珠母贝的相关研究未见报导。课题组前期通过高通量测序已获得马氏珠母贝珍珠囊转录组数据库，本项目以此为基础进一步采用生物信息学方法筛选马氏珠母贝miRNA并从中分析珍珠质形成相关的miRNA，通过荧光定量，原位杂交，northern blot鉴定特异性miRNA的表达，通过western blot鉴定它们与靶标基因的靶向关系，并在贝体内通过干预miRNA表达来验证特异性miRNA对珍珠质形成的调控作用及调控机制。本研究将是珍珠质形成机制研究新的切入点，为阐明miRNA调控生物矿化的基因级联机制奠定基础，对于解释马氏珠母贝的其它各种生物功能提供新思路。

虽然对贝壳和珍珠形成的相关分子生物学研究取得了很大进展，但对珍珠形成过程的表达调控机制还不清楚。microRNA（miRNA）是近年来发现的能够在转录后水平调节基因mRNA表达的一组非蛋白编码小RNA分子，广泛存在于病毒、线虫、植物到动物体内，具有强大的调控基因表达作用，并参与多种生物学功能调节的单链RNA分子。本研究采用生物信息学分析结合高通量测序共获得了288个马氏珠母贝miRNAs，其中包含235个保守的miRNAs，53个马氏珠母贝特异性miRNAs；通过靶向预测筛选出13个珍珠质形成相关miRNAs（miR-2305、miR-2418、let-7b、let-7、let-7e、miR-133、miR-2386、miR-15、miR-146、miR-9a、miR-124、miR-10a、miR-29a）。组织定量分后进一步筛选出6个珍珠质形成相关基因（miR-2386、miR-2305、let-7e、let-7、miR-15和miR-29a）。体内过表达实验证实，miR-2305和miR-29a异常表达会导致珍珠层的形成异常，因此锁定miR-2305和miR-29a为研究对象进行深入研究。通过靶向预测和双荧光素酶实验证实miR-2305与pearlin和pif-177之间，miR-29a与neuropeptide Y receptor type 2（NPY2）之间存在靶向调控关系。荧光定量和western blotting实验证实miR-2305过表达后显著性的抑制了pearlin和pif-177基因和蛋白质的表达，说明miR-2305通过靶向抑制pearlin和pif-177基因的表达，参与调控贝壳珍珠层的形成。miR-29a过表达后NPY2基因的表达水平显著性降低，同时免疫反应相关因子NF-kb和IL-17的表达显著性上调，说明miR-29a通过靶向调控NPY2不仅参与调控贝壳珍珠层的形成，还参与调控珍珠贝的免疫反应。本研究为阐明贝类生物矿化的基因级联机制奠定基础，对于解释马氏珠母贝的其它各种生物功能提供新思路。