肝细胞癌的一种新亚型:双表型肝癌的细胞分选、分子生物学特性及其临床病理学意义

我们前期在对肝细胞癌(HCC)表型特征的研究中，观察到约10%的HCC中>15%的HCC细胞能同时强表达肝细胞和胆管细胞两种不同细胞谱系的标志物，我们称之为双表型HCC(DPHCC)。与仅表达肝细胞性标志物的单表型HCC相比，DPHCC在细胞分化、血管侵犯和术后生存率等方面均表现出更加恶性的生物学特性。据此，我们推测DPHCC是HCC的一种新亚型。本课题拟从DPHCC中分选双表型细胞，观察该细胞在裸鼠接种建模和体外诱导分化条件下的成瘤能力、细胞分化模式以及子代细胞的表型特点；与单表型HCC细胞和人肝前体细胞系对比，观察与双表型细胞在基因芯片表达谱、重要信号转导通路和相关蛋白的表达水平，以及基因组微卫星杂合性缺失谱上的差异；结合对200例手术切除DPHCC的临床病理学多变量统计学分析，以期提出DPHCC的细胞起源路径、分子变异特征、双表型现象对细胞生物学行为的影响、诊断标准以及临床诊治策略。

（1）双表型肝细胞癌(DPHCC)的临床病理学研究：对经手术切除并病理证实的1,530例肝细胞癌(HCC)进行了Hep Par-1、pCEA、CK19和MUC-1等免疫组化标记，以肝细胞标志物(Hep Par1/pCEA)和胆管细胞标志物(CK19/MUC-1)同时阳性的癌细胞数≥15%作为DPHCC的诊断标准，筛选出目前文献中最大一组155例(10%)具有DPHCC特征的病例，进行术后10年生存率和复发率随访。另外随机选择同期手术切除的144例仅表达肝细胞性标志物的普通HCC作为对照。结果显示，DPHCC与普通HCC在细胞和组织学形态上虽然相似，在病理切片上难以区分，均可以同时强表达肝细胞和胆管细胞标志物。此外，临床与病理学参数的对比分析发现，DPHCC在肝硬化发生率、血清AFP阳性率、肿瘤细胞分化分级、癌栓形成、包膜侵犯和卫星灶形成等方面均呈现出更为恶性的生物学行为。经过对DPHCC患者和普通HCC患者预后的比较分析发现，DPHCC患者的预后要显著差于普通HCC患者。另外，COX回归分析显示，CK19表达强度、肿瘤个数、TNM分期和血清HBsAg是患者总生存时间和无病生存时间的独立预测指标。基于上述研究结果，我们推测，DPHCC是HCC家族中一种新的特殊类型，其恶性程度更高。上述结果对于深入探讨HCC的异质性特点、分子克隆起源机制和个体化路径治疗新策略可能具有重要的意义，同时为下一步的分子机制研究提供了基础依据。.（2）DPHCC的分子生物学特性研究：我们以CK19为DPHCC特征性分子，以在SMMC7721、MHCC-97L、MHCC-97H等HCC细胞株进行了CK19的过表达及干扰实验。首先，构建了CK19过表达慢病毒载体和CK19 RNA干扰慢病毒载体，然后转染至293T细胞，制备过表达慢病毒感染SMMC7721和MHCC-97L，用RNA干扰慢病毒感染MHCC-97H。结果显示，过表达慢病毒感染后的SMMC7721和MHCC-97L的细胞增殖、细胞凋亡、克隆形成等没有明显变化；而CK19 RNA干扰慢病毒感染对MHCC-97H细胞的生物学行为的影响则非常显著，即CK19表达减少后，导致了MHCC-97H细胞增殖能力得到明显抑制、细胞凋亡显著增加、克隆形成能力显著减少，侵袭能力降低。裸鼠皮下种植瘤的重复实验即将完成，正在撰写SCI论文。