Streptomyces sp. NEAU6代谢的新植物生长调节剂五谷丰素生物合成研究

A novel plant growth regulator wugufengin was isolated from endophytes Streptomyces sp. NEAU6 by our group. It exhibits a dual and specific functions demonstrating the bioactivities of auxin and cytokinin, which can significantly promote the growth of root and shoot. As a new adenosine derivative, wugufengin consists of an adenine and a rare sugar D-psicose, and this unique structure is significantly different with other adenine-related cytokinins including zeatin, 6-benzylaminopurine and N6-isopentenyladenine. In order to elucidate the biosynthesis of wugufengin, we intend to clone the gene cluster of wugufengin on the basis of the complete genome sequence of S. sp. NEAU6. After that, the functions of genes and proteins in sanqimycin biosynthetic pathway will be characterized by gene knockout and gene complement, especially the mechanism of D-tagatose 3-epimerase and adenine phosphoribosyl transterase. This study will hold the promise to find a new catalytic and biosynthetic mechanism of nucleoside-related compounds, and will facilitate and set the stage to biosynthetically engineer new wugufengin analogues by combinatorial biosynthesis and synthetic biology.

五谷丰素是课题组从植物内生放线菌Streptomyces sp. NEAU6中发现的新型植物生长调节剂，具有植物生长素和细胞分裂素，显著促进植物根、芽生长的双重独特功效，对作物增产明显。五谷丰素属腺嘌呤核苷类化合物，但化学结构与商品化应用的嘌呤类细胞分裂素玉米素、6-苄氨基腺嘌呤、N6-呋喃甲基腺嘌呤等差异大，由稀有糖阿洛酮糖与腺嘌呤结合成新结构的核苷。为阐明五谷丰素的生物合成，对已完成全基因组测序的放线菌NEAU6，进行五谷丰素生物合成基因簇克隆，并经体内基因敲除与回补，明确相关的各个基因及编码蛋白的功能，重点研究生物合成途径中的阿洛酮糖表异构酶、腺嘌呤磷酸阿洛酮糖转移酶的酶催化机理，在基因和酶学水平上阐明五谷丰素的组装机理。研究有望发现酶催化的新核苷类化合物生物合成的新化学机制和新的生物合成途径，为组合生物合成与合成生物学研究获得新活性化合物，及深入研究五谷丰素的生物合成调控奠定基础。

五谷丰素是一种新型植物生长调节剂，已在我国注册为新型农药。它在结构上包含一个稀有的阿洛酮糖糖配基，并通过一个独特的C-N糖苷键连接到腺嘌呤上。近来的研究已经重构了五谷丰素的体外生物合成途径。然而，由于缺乏反应中间体，GvmB、C、D和E催化的反应尚未得到明确的证实。在此，我们通过基因中断和异源表达实验，确定了Streptomyces caniferus NEAU6中负责五谷丰素生物合成的基因簇。我们同时化学合成了一种关键中间体psicofuranine 6'-phosphate (PMP)，并对gvmBCDE基因产物进行了体外表征，确定了它们在五谷丰素生物合成中的催化作用。结果还表明，五谷丰素生物合成途径与初级代谢的腺嘌呤补救途径相互重叠。通过体外酶学表征和酶促反应动力学分析我们鉴定了一个LONELY GUY-1同源蛋白GvmA的功能。该酶在五谷丰素生物合成中起到双重作用，其不仅为五谷丰素生物合成提供底物腺嘌呤，而且能够减轻了两种途径之间的直接竞争，确保了五谷丰素的有效合成。此外，我们还制备GvmE与产物PMP的共晶结构。我们通过氨基酸定点突变和酶促反应动力学确定了该酶C末端的Glu160是其重要催化位点，而其同源蛋白的行使相同功能的氨基酸残基是位于催化环上。因此，本研究证明了GvmE是一个非典型的腺嘌呤磷酸核糖转移酶。本研究不仅拓展了对核苷类抗生素生物合成新的认知和天然产物合成新型酶库，而且为进一步通过生物合成途径改造提高五谷丰素产量奠定了基础。