新一代促进微管降解并能克服多药耐药的微管降解剂SKLB-2H作用位点和抗耐药分子作用机制研究

As the most hot target of antitumor drugs, microtubule is a stable and efficient target. Structural biology of anti-microtubule drugs and tubulin complexes could reveal how the drug affect microtubule dynamic balance, and this molecular mechanism is important for drug design to overcome drug-resistant. In our previous study, using X-ray crystallography and biochemical methods, we have found a serious small molecule could promote the degradation of tubulin heterodimers in time and concentration dependent manner without affecting its mRNA level. Also, these compounds could overcome mult-drug resistance. we first named these compounds as a new microtubulin degradation agents, Among which the most active compound is SKLB-2H. This project will carry out the following work on the microtubule degradation agent SKLB-2H: (1) determining the binding site of SKLB-2H by competitive binding experiments; (2) analyzing the specific mechanism of action of SKLB-2H for promoting tubulin degradation; (3 ) Analyzes the crystal structure of the SKLB-2H and tubulin complexes, elucidating from a structural biology perspective why SKLB-2H promotes tubulin degradation.

微管作为抗肿瘤药物的靶点具有稳定、高效等特点，是抗肿瘤药物研究最炙手可热的靶点，抗微管药物和微管蛋白复合物的结构生物学研究对揭示药物影响微管动态平衡的分子机理和指导克服耐药的抗微管新药设计具有重要意义。本项目前期通过X射线晶体衍射技术、生物化学方法，发现了一类具有抑制微管聚合、能够时间、浓度依赖的促进微管蛋白异二聚体的降解。而不影响其mRNA水平、且能克服耐药的的新型微管抑制剂降解剂，我们将这类化合物首次命名为新型微管降解剂，其中活性最好的化合物该命名为SKLB-2H。本项目将对微管降解剂SKLB-2H开展如下工作：（1）通过竞争结合实验确定SKLB-2H的结合位点；（2）解析SKLB-2H促进微管蛋白降解的具体作用机制；（3）解析SKLB-2H与微管蛋白复合物的晶体结构，从结构生物学角度阐述为何SKLB-2H促进微管蛋白降解。

本研究中，经过大量3-氨基-β-咔啉类化合物的文献调研基础上合成了化合物47和48，考察了化合物48的体内体外抗肿瘤活性。结构生物学实验进一步证实了48靶向秋水仙碱位点，且咔啉环上的吡啶N原子与Glu198的氨基酸形成了很强的H键，Linker部分的N原子与Glu198和Tyr200形成了H键。为进行构效关系讨论，共合成了8个化合物，构效关分析表明咔啉环上的吡啶N原子是48促进微管蛋白降解的关键基团。Glu198和Tyr200的氨基酸突变实验证明咔啉环上的吡啶N原子与Glu198形成的H键是48促进微管蛋白降解的关键因素。在秋水仙碱位点与48具有相同结合模式且同样与Glu198形成了很强H键的Nocodazole和Plinabulin均不能促进微管蛋白降解，提示N48-pyrdine-Glu198之间的H键不是常规的H键。QM/MM计算结果表明N48-pyrdine-Glu198之间形成的H键属于低势垒H键，即LBHB。基于前面的中48-tubulin的晶体复合物结构，我们通过四个合理的结构修饰合成了54个3-氨基-β-咔啉类衍生物，详细的讨论了3-氨基-β-咔啉类衍生物的构效关系。通过构效关系讨论，我们优选出化合物91b (IC50 = 9 ± 3 (MCF-7), 5 ± 1 (HeLa), 13 ± 1 (Raji), 14 ± 2 (H460), 8 ± 0.2 (A2780S) nM)，91b同样靶向秋水仙碱位点，且能通过泛素化途径促进微管蛋白降解，免疫荧光实验证实其在细胞内能清除微管，能够克服多药耐药，将细胞周期阻滞在G2/M期并诱导细胞凋亡，抑制HUVECs的迁移。药代动力学研究表明91b的口服生物利用度达到了30.19%，体内动物实验表明其具有较好的抑瘤效果。总的来说，91b的体内体外实验研究表明其是一个很好地潜在地抗肿瘤候选药物。