大鼠曲细精管微环境和miRNA对Leydig干细胞的调节机制研究

Stem Leydig cells (SLC) have the potentials to be alternative therapy of testosterone deficiency (TD). The hallmark of SLC is their capability of self-renewing and of specifying into Leydig cell lineage. A fundamental unanswered question is how SLC are specified, maintained and instructed to differentiate into Leydig cells. Both external signals (SLC niche) and intrinsic cues are required to regulate the self-renewal and specification of SLC. Our recent data support the contention that the outer layer of the seminiferous tubule (ST) is a critical niche for SLC that specifies differentiation into cells of the ALC lineage in vitro. There also are intrinsic cues, including transcription factors and miRNAs that are involved in orchestrating SLC self-renewal and specification. Our goals in this application are to: 1) to determine how the niche controls SLC self-renewal/differentiation and how different extrinsic (niche) and/or systemic factors also contribute to amplifying SLC numbers and/or differentiation; 2) to determine how intrinsic cues, including transcription factors, methylation status of transcription factor steroidogenic factor 1 (NR5A1), and miRNAs regulate self-renewal and specification of SLCs.

睾丸Leydig干细胞（SLC）有潜力治疗睾酮缺乏症。 SLC的特点是具有自我更新和向睾丸Leydig细胞系分化的能力。一个基本的悬而未决的问题是如何造成SLC增生和向睾丸Leydig细胞分化。SLC自我更新和分化的调节需要微环境的外部信号和内在线索。我们最近的数据支持这一论点，即外层的曲细精管是SLC向Leydig细胞分化的关键微环境。内在的线索包括转录因子和miRNA。在此申请中，我们的目标是：1）确定SLC自我更新和向Leydig细胞系分化的微环境因子（包括PDGF和Wnt信号通路）; 2）确定转录因子如类固醇生长因子1（NR5A1）的甲基化状态和miRNA如何调节SLC的自我更新和分化。

男性激素对生殖功能至关重要。睾酮缺乏也会造成一系列的代谢和健康异常，包括体重减轻、骨矿物质密度降低、内脏脂肪增加、性欲和性功能降低以及情绪改变和疲劳等。目前在临床上，这些疾病通过外源性睾酮治疗。但是，外源性睾酮给药有可能增加心血管疾病和前列腺肿瘤发生的风险。因此，寻找一种能够增加血清睾酮水平的细胞疗法对于许多性腺机能减退的男性是非常迫切的。男性睾酮主要由睾丸间质细胞分泌。睾丸间质干细胞（Stem Leydig Cell，SLC）具有修复，维持间质细胞群体稳定的功能。SLC的特点是自我更新能力和向睾丸间质细胞系分化能力。关于SLC悬而未决的问题包括：SLC表达哪些特异性标志物？它们在睾丸间质中是如何分布的？调控它们增殖跟分化的细胞外因子是什么？决定它们增殖跟分化的细胞内调控机理是什么？本课题利用独特的曲细精管培养技术、流式光度计分离技术以及基因芯片等技术，对这些基本问题做了初步研究。我们发现：在成年睾丸中，曲细精管外表面是SLC生存的一个主要位置；这些细胞特异性的表达CD90；SLC的增殖主要受FGF2、PDGF、Activin和DHH信号通路的激活，并受TGFb，PKA和雄激素DHT的抑制；同时，SLC的分化主要受DHH、锂离子、PDGFAA和Activin的激活，并受TGFb、FGF2 和PDGFBB的抑制。DHH信号通路是调控SLC分化最关键的因素。激活该信号通路，能在其它旁分泌细胞及调控因子缺乏的情况下，成功地启动SLC向间质细胞谱系的分化。另外，我们利用曲细精管移植技术，第一次在动物体内，睾丸外组织（皮下）成功地实现了SLC向间质细胞的发育。由于皮下发育雄激素分泌细胞，会受下丘脑-垂体轴系的调控。此类在靶器官外组织生长内分泌细胞的设想和技术，将彻底改变干细胞治疗各类激素缺乏症的思维模式。为干细胞临床治疗激素低下提供新的途径和可能性。本课题组通过鉴别，培养，生长睾丸间质干细胞，以及寻找能调控该细胞的各种因子，不光为干细胞治疗睾酮低下打下牢固基础，也极大的扩展了人们对成年干细胞调控的普遍认知。实验结果对基础和临床皆有重要的意义。