野油菜黄单胞菌中3-酮脂酰ACP还原酶在DSF合成中的功能研究

Xanthomonas is one of the most important phytopathogens，which have been shown to infect more than 400 plant species, including those agriculturally important crops, such as rice, cotton, soybean, etc. DSF (Diffusible signal factor)is a novel quorum sensing signal identified in Xanthomonas, and DSF-dependent quorum sensing is one of the most important mechanism to control virulence and environmental adaption in Xanthomonas. Till now, DSF's chemical structure, DSF signaling pathway, the auto-induction mechanism and the synthetase RpfF in DSF biosynthesis have been elucidated. However, little is known about the source and biosynthetic pathway of 3-hydroxylacyl-ACP, the precursor for DSF synthesis. Our study showed that FabG2 in Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), a causal agent of black rot in crucifers, has 3-ketoacyl-ACP reductase activity for short- or medium-chain substance, and FabG2 affects DSF biosynthesis. Based on the results, our proposal sets out to investigate three important and interesting questions in Xcc: (1) to study the function of FabG analogues in fatty acid biosynthesis through comparative genomics and bioinformatic analysis, deletion analysis; (2) to characterize the biochemical activity of FabG2 in DSF synthesis through gene deletion, overexpression, and biosynthetic pathway establishment in vitro; (3) to study the relationships between fabG2 expression and bacterial cell growth, DSF synthesis and DSF signal transduction through RNA quantitative analysis. Characterization of FabG2 in DSF synthesis and signal transduction, and elucidation of the precursor resource of DSF synthesis, are essential to not only understand the pathogenesis of the phytopathogen, but also to facilitate the discovery of novel methods or biopesticides to effectively control Xanthomonas infection.

黄单胞菌是一类危害巨大的农作物病原菌，而DSF依赖的群体感应系统是调控黄单胞菌致病性的重要方式。目前已系统地阐明了DSF的化学结构、生物学功能、信号传导途径以及合成关键酶RpfF的功能，但DSF合成前体来源和合成途径还不清楚。研究结果显示野油菜黄单胞菌FabG2具有专一性的中短链3-酮脂酰ACP还原酶活性，影响DSF合成。因此本项目研究内容如下：（1）通过比较基因组学和突变与功能分析等方法，研究多个FabG在脂肪酸合成中的功能；（2）通过基因突变、过表达、体外重建等方法，研究FabG2在DSF合成中的功能；（3）采用定量方法，研究FabG2表达与DSF合成、信号传导的相互关系。本项目的目标是从遗传学、分子生物学和生物化学等角度，研究FabG2在DSF合成与信号传导中的生物学功能，预期成果将揭示DSF合成前体的来源，为阐明黄单胞菌的致病机理奠定基础，并为筛选高效、环保的新型农药提供新的策略。

野油菜黄单胞菌（Xcc）能侵染所有的十字花科植物，引起黑腐病，在世界范围内造成巨大的经济损失。Xcc在侵染寄主植物过程中需产生多种致病因子，而致病因子的产生受到由DSF（Diffusible signal factor）信号介导的群体感应系统的严格调控，因此控制DSF合成是防控黑腐病病害的重要切入点。脂肪酸合成系统中3-酮脂酰ACP还原酶（FabG）催化生成DSF合成前体3-羟基脂酰ACP，影响DSF产量。而Xcc基因组编码多个FabG同源蛋白，但具体生物学功能还不清楚。.本项目利用异体遗传互补、体外活性分析等方法，研究证明Xcc中FabG1、FabG2和FabG3都具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，但FabG2只对中长链（≥C8）底物具有催化活性；而FabG1和FabG3能催化不同链长（C4-C12）底物，但FabG3活性仅有FabG1活性的10%-50%。fabG1是必需基因，只有过表达fabG2并且添加辛酸才能获得敲除突变株。但fabG2被敲除后不影响菌体的生长，但影响脂肪酸的组成。同时，fabG2突变株的DSF产量显著下降（< 50%），而过表达fabG1或fabG2也能显著提高DSF产量。fabG3也不是生长的必需基因，其突变株生长速度与野生菌无差异，但突变株对H2O2的耐受性下降，菌落颜色变为白色，而回补fabG3后菌落颜色恢复为黄色，说明FabG3是Xcc菌黄素合成的关键酶。fabG3突变株脂肪酸组成与野生菌无差异，但回补其他3-酮脂酰ACP还原酶基因都不能恢复突变株菌黄素合成，说明FabG3不参与脂肪酸合成，但在菌黄素合成中发挥独特作用。fabG3突变株对寄主植物的致病力显著下降，但胞外酶、胞外多糖等致病因子无差异。另外，通过多种方法测定fabG3突变株的DSF信号分子产量显著下降，而回补fabG3或过表达fabG3都能显著提高DSF产量，说明FabG3参与DSF信号分子合成。测定无细胞抽提物中3-酮脂酰ACP还原酶活性，证明Xcc通过调节细胞内总活性影响DSF信号分子产量。因此，本项目研究证实FabG2和FabG3都是新型3-酮脂酰ACP还原酶，其中FabG2具有长链底物选择性，FabG3特异性参与菌黄素合成；同时FabG2和FabG3都参与DSF信号分子合成，影响菌体的致病性；fabG3突变株菌黄素合成中断，可作为基因工程菌用于生产无色黄原胶。