野油菜黄单胞菌菌黄素卤代酶的鉴定和功能研究

Xanthomonadins are brominated aryl-polyene yellow pigments produced by the phytopathogens Xanthomonas genus. Xanthomonadins play important roles in maintaining the ecological fitness and pathogenicity by protecting bacterial cells against photooxidative damage and improving epiphytic survival. Bromination modification of xanthomonadin is rare from terrestrial microorganism, however, the molecular mechanism and biological role of the bromination modification still remain unclear. We previously identified the xanthomonadin biosynthetic gene cluster in X. campestris pv . campestris wild-type XC1 strain. Based on the previous results, we plan to further identify the genes encoding the halogenase for xanthomonadin biosynthesis by gene mutation and complementation. The biochemical function of the halogenase will be characterized by in vitro reconstitution of the bromination step in xanthomonadin biosynthetic pathway. To further understand the catalytic mechanism of the halogenase, we will try to resolve the protein crystal structure via X-ray diffraction. To reveal the biological role of the bromination modification for xanthomonadin, the phenotype including photosensitivity, antioxidative ability, and pathogenicity of the bromination-deficient mutants would be tested. The project could forward our understanding of xanthomonadin biosynthetic mechanisms and provide alternative targets for anti-Xanthomonas agents. Function analysis of the halogenase could also expand the theory and application of halogenase in natural product research.

菌黄素是植物病原黄单胞菌产生的一种溴化芳香基多烯脂类黄色素，能保护细菌抵抗光氧化损伤，协助细菌在植物叶片和维管组织中生存，在黄单胞菌环境适应性和致病性发挥重要作用。溴化是菌黄素独特的结构修饰，但溴化修饰的分子机理和生物学意义还有待进一步研究。课题组前期初步分析了野油菜黄单胞菌XC1菌株中菌黄素生物合成基因簇的功能并预测了两个卤代酶基因。本项目在前期研究的基础上，通过基因敲除和回补鉴定XC1菌株菌黄素卤代酶基因；通过构建体外酶活反应体系，验证卤代酶的生化功能；通过解析卤代酶的晶体结构，阐述其催化机制；通过分析卤代酶突变体光敏感性、抗氧化性、致病性等表型，明确菌黄素溴化修饰的生物学意义。本研究的开展能进一步完善菌黄素的生物合成途径，为研发黄单胞菌防治药剂提供新的靶标。菌黄素卤代酶的研究还将丰富天然产物卤代酶的理论研究和实践应用。

菌黄素是植物病原黄单胞菌产生的一类重要的代谢产物，能保护细菌抵抗光氧化，促进细菌的附生性。因此菌黄素是一种致病因子，在细菌致病性和环境适应性方面发挥十分重要的作用。菌黄素具有独特的溴化修饰，这在陆生微生物群体中较为罕见。本项目聚焦菌黄素生物合成途径中的溴化反应，以野游菜黄单胞菌和水稻白叶枯菌为研究对象，综合利用生物信息学、遗传性、生物化学和结构生物学方法研究了三方面的科学问题：（1）菌黄素溴化酶基因的鉴定；（2）溴化酶XanJ的酶学功能和催化机制；（3）菌黄素溴化修饰的生物学意义。本项目主要取得以下结果：（1）鉴定了负责菌黄素溴化修饰的两个关键基因xanJ和xanB1，鉴定了菌黄素组分一溴菌黄素甲酯的结构，基本明确了xanJ负责多烯链上的溴化修饰，而xanB1负责芳香环上的溴化修饰。（2）初步阐述了XanJ的酶学功能，排除了XanJ作用在前体分子3-羟基苯甲酸（3-HBA）或3-HBA-ACP的可能性。（3）解析获得了XanJ的结构学特征，分析了XanJ的保守活性位点，并利用分子对接预测了XanJ的作用底物可能是羟基肉桂酰-ACP或β-酮酰基-ACP，进一步阐述了XanJ的功能。（4）表型分析发现，缺失溴化菌黄素不影响细菌致病性及致病因子胞外多糖和胞外酶的合成。本课题的研究结果进一步拓展了菌黄素的生物合成机制，并有助于认识黄单胞菌的致病机理，为黄单胞菌病害的防控提供理论依据。