基于p62介导的自噬与抗氧化交互调控机制探讨清热化瘀方对脑缺血损伤大鼠的保护作用

The regulation of autophagy has become the key issue to ischemic stroke. The interaction of regulatory signals of autophagy and antioxidantion play an important role in ischemia-reperfusion(I/R) injury which mediated by factor P62, however, the regulation mechanism remains to be further study. Qingre Huayu Prescription(QRHYP) has a significant clinical effect on treating ischemic stroke and previous studies have confirmed the Prescription can protect neurons by inhibiting endoplasmic reticulum stress after cerebral I/R injury, but its mechanism needed to further study. In our project, MCAO rat models will be made by filament occlusion to observe neurons autophagy in transmission electron microscopy and the location of p62/ LC3 and Keap1 in Laser confocal microscope, and then test the expression of autophagy factor p62,LC3 and antioxidant activity pathway associated gene Keap1, Nrf2, NQO1, GCLC in the penumbra region at different points after I/R injury by immunohistochemistry, RT-PCR and Western Blot methods. And then observe the influnence of QRHYP on the expression of related genes in singnal pathway mediated by p62. The purpose of our project is to develop new ideas for preventing cerebral ischemia injury and to lay a solid foundation for the clinical application of QRHYP.

自噬调控成为抗缺血性中风一个关键问题。p62介导的自噬与抗氧化交互调控信号在脑I/R损伤过程中发挥重要的作用，但其调控机制尚需进一步研究。清热化瘀方为治疗脑梗死疗效显著的中药复方，前期研究证实该方能通过抑制脑I/R损伤后内质网应激，保护神经元，但其机制有待于进一步阐明。本研究采用线栓法制备大鼠MCAO模型，采用免疫组化、qRT-PCR 及 Western Blot等技术检测I/R损伤后不同时间点缺血半暗带自噬因子p62、LC3和抗氧化通路Keap1、Nrf2、NQO1、GCLC等基因的表达变化；透射电镜检测自噬；激光共聚焦显微镜检测p62/LC3和p62/Keap1的共定位。并以清热化瘀方做干预，观察其对p62介导的信号通路相关基因表达的影响，以进一步探讨其神经保护机制。以期为缺血性脑损伤的防治开拓新思路，并为该方更好的应用于临床夯实基础。

脑血管疾病是中老年人的常见病、多发病，是现今人类死亡率最高的三大疾病之一。随着人口老龄化社会的到来，缺血性脑血管病发病率有明显上升趋势，这给家庭、社会带来了巨大的精神、物质负担。探讨缺血性脑卒中的发病机制、积极寻找其它有效的治疗靶点是研究的热点和难点。p62介导的自噬与抗氧化交互调控信号在脑缺血再灌注（I/R）损伤过程中发挥重要的作用，但其调控机制尚需深入研究。清热化瘀方为治疗脑梗死疗效显著的中药复方，前期研究证实其能通过抑制脑I/R损伤后内质网应激，保护神经元。本项目即是试图通过拮抗p62的下调，可抑制自噬的过度激活，同时可使p62与Keap1结合，减少Keap1产生，激活抗氧化应激通路，发挥p62调控氧化应激和自噬的双重保护作用。.研究采用线栓法制备大鼠MCAO及大脑中动脉I/R模型，应用免疫组化、RT-PCR及Western blot等技术检测I/R损伤及清热化瘀方干预后不同时间点脑皮质缺血半暗带中p62-LC3自噬通路p62、LC3和p62-Keap1抗氧化通路Keap1、Nrf2、NQO1、GCLC、HO-1等基因及蛋白的表达变化；通过透射电镜检测自噬的发生；采用激光共聚焦显微镜免疫荧光双重标记技术检测p62/LC3和p62/Keap1的共定位；应用TTC染色观察脑梗死体积。.动物实验显示大鼠脑缺血再灌注损伤后LC3 和Keap1表达水平增加，而p62表达减少，并同时激活了Nrf2信号通路下游因子NQO1、GCLC和GCLM，诱导了细胞自噬和氧化应激的发生。清热化瘀方可通过升高p62的表达，减少LC3的表达从而抑制细胞过度自噬，并减少Keap1生成，促进Nrf2通路相关基因Nrf2、NQO1、HO-1、GCLC和GCLM的产生，从而激活抗氧化应激通路，增加ROS水平，降低GSH活力，减少细胞自噬、神经功能缺损和脑梗死体积，发挥调控氧化应激和自噬的双重保护作用。我们的临床观察也显示清热化瘀方可明显改善中风患者神经缺损、运动功能，临床效果确切。这就进一步阐明了脑I/R损伤的作用机制，解释了本方干预脑I/R损伤的作用途径，从而为脑I/R损伤机制及中药清热化瘀方干预靶点提供了新思路及科学依据，对推动中医药发展起到积极作用，具有重要推广意义。