BR调节钙氢离子交换蛋白的功能研究

Brassinosteroids (BRs) are a group of phytohormones that regulate various biological processes in plants. Recent studies of the BR signaling network have revealed extensive signal integration through direct interactions between components of different signaling pathways. BR has been shown to increase cytosolic Ca2+ level, however the molecular mechanism is not clear. Ca2+: H+ exchangers localize in the tonoplast membrane, and are assumed to contribute important role in changing the cytoplasmic Ca2+ concentration. Our lab’s proteomics studies have shown that BR treatment induces the phosphorylation of the N-terminal region of two Ca2+: H+ exchangers CAX1 and CAX3. The results support a hypothesis that BR regulates the Ca2+ level through the phosphorylation of CAX protein. Our research focuses on testing this hypothesis. We plan to mutagenize the phosphorylation sites in CAX1, and transformed wild type and the mutant genes into the cax1/cax3 mutant. Analysis of the cytosolic Ca2+ levels before and after BR treatment will reveal the function of phosphorylation in regulating CAX activity and mediating BR regulation of Ca2+ level. We also plan to identify the interacting kinase and phosphotase of CAX proteins, by affinity chromatography followed by quantitative Liquid chromatography-tandem mass spectrometry. This work will uncover the molecular link between two important signals, BR and Ca2+.

油菜素甾醇类（Brassinosteroids, BRs）是调节植物生长发育的重要激素。BR信号通路中的多个激酶/磷酸酶可对其他信号通路的蛋白进行磷酸化修饰，影响并作用于其他信号通路。BR处理引起植物胞质内钙离子浓度升高，但分子机理尚不明确。钙氢交换蛋白是液泡膜上重要的钙离子通道，对胞质钙离子浓度具有重要调节作用。本实验室前期蛋白组学研究发现，BR处理拟南芥后引起钙氢交换蛋白CAX1（Cation exchanger 1）和CAX3的N端功能抑制结构域磷酸化增强，BR信号可能通过改变CAX蛋白的磷酸化来调节其功能。我们计划突变受磷酸化调节的氨基酸后转化cax1/cax3突变体，分析磷酸化调节CAX活性和BR响应的功能。此外我们还将使用亲和层析结合定量质谱分析方法鉴定调控CAX磷酸化的激酶/磷酸酶。本课题将解析BR信号在翻译后水平调控胞质钙离子浓度的分子机制，并阐明这两个重要信号之间的关系。

油菜素甾醇类(Brassinosteroids, BRs)是植物中一类重要的甾醇类激素，调控了众多的生物学过程。外源BR处理可以让拟南芥叶片胞质内钙离子浓度升高。近期研究表明BR信号通路与多个植物体内的其他信号通路相互交叉、彼此协调控制植物生长发育，但是BR信号如何调节钙离子，其分子机制尚不清楚。本实验室前期的蛋白组学结果显示，BR 处理拟南芥后引起位于液泡膜上的钙氢交换蛋白CAX1(Cation exchanger 1) N端结构域的Thr20和Ser24位氨基酸磷酸化增强。本课题采用了定点突变、钙指示蛋白和蛋白质组学的方法研究了BR与两个钙氢交换蛋白CAX1和CAX3的关系，初步解析了其分子机制。突变Thr20和Ser24为丙氨酸并转化cax1cax3突变体。结果显示，野生型的CAX1不能互补cax1cax3双突变体，而经过点突变的蛋白可以部分恢复突变体的表型，表明两个磷酸化位点对CAX1蛋白的N端自抑制有重要功能。为了进一步了解BR通过CAX蛋白影响钙离子浓度，我们利用钙离子指示蛋白YC3.6来观察BR处理胞质钙离子的反应，结果显示BR处理使拟南芥根伸长区而不是分生区细胞内钙离子浓度升高。利用CAX1、CAX3过表达植株，使用免疫沉淀结合质谱技术鉴定了218个CAX相互作用蛋白，其中激酶2个，磷酸酶2个。为进一步阐明BR调控CAX蛋白磷酸化的分子机制提供了可能。此课题为后续了解BR信号在翻译后水平调控胞质钙离子浓度，阐明两种植物信号途径的交流起着重要作用。